p38MAPK与2型糖尿病大鼠大血管病变的关系及二甲双胍的干预作用

摘要

目的:2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)是一种多基因遗传的代谢性疾病，约80％的T2DM患者死于大血管并发症，如心肌梗死、脑卒中等，大血管病变是我国T2DM患者主要的致残、致死原因，是危害最大的DM慢性并发症。糖尿病大血管病变包括心、脑和周围大血管病变，主要以动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)为病理基础，它与单纯的AS相比病变范围大、程度重、发生早。研究显示，AS的病理改变与丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)的过度激活有关，p38MAPK通路属于MAPK家族，与内皮细胞损伤关系密切，是参与炎症反应的细胞内的重要通路，由此推测磷酸化p38MAPK参与了T2DM大血管病变的发病过程。二甲双胍除能够有效降低血糖，降低血浆胰岛素水平及增加胰岛素敏感性外，还有抗炎、抗氧化应激、改善血管内皮功能等作用。本实验通过高糖、高脂饮食联合腹腔内小剂量注射链脲佐菌素制备T2DM大鼠模型，继而采用二甲双胍进行干预治疗，实验结束后检测各组大鼠胸主动脉中磷酸化的p38MAPK蛋白表达水平变化，探讨p38MAPK与糖尿病动脉粥样硬化的关系及二甲双胍对T2DM动脉粥样硬化的影响及其机制。
　　方法:建立2型糖尿病大鼠模型:选用4周龄健康雄性Wistar大鼠25只，适应性饲养1周后，按照随机数字表将大鼠随机分为对照组(NC，n=6)和实验组(EX，n=19)。NC组采用标准饲料喂养; EX组采用高脂高糖饲料喂养（20％的蔗糖、10％的熟猪油、2.5％的胆固醇、1％的胆酸、66.5％的标准饲料）。喂养4周后，EX组大鼠隔夜空腹腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg，（用前以PH4.4的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配成1％的浓度），对照组仅注射等容积的柠檬酸缓冲液。于实验的第6周即注射STZ2周后，选择空腹血糖≥7.8 mmol/L者为糖尿病成模大鼠。19只EX大鼠中造模成功者15只，将成模糖尿病大鼠随机分为2组:2型糖尿病空白对照组(DM-C，n=7)、2型糖尿病+二甲双胍干预组(DM-T，n=8)。DM-T组给予二甲双胍200 mg/kg溶于大鼠饮用水中灌胃，每日一次，NC组和DM-C组给予等量的饮用水灌胃，每周称体重1次，共8周。整个实验过程共持续14周。于实验第14周末分别测量各组大鼠体重，行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)，并计算葡萄糖曲线下面积(Glucose Area underthe curve，AUCg)，胰岛素曲线下面积(Insulin Area under the curve，AUCi)，胰岛素抵抗指数(HOMA-IR，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5)和胰岛β细胞功能指数[HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5)]。心尖取血并分离血清，测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，ICAM-1，VCAM-1，NF-κB水平，取胸主动脉进行HE染色，光镜下观察血管病理变化;免疫组化法测定胸主动脉中磷酸化的p38MAPK，NF-κB，MCP-1的蛋白表达水平。采用SPSS16.0统计软件进行分析，正态分布的数据以均数±标准差（(x)±s）表示，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1实验6周末数据
　　对照组大鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，FBG)为6.50±0.52mmol/L，实验组FBG为16.56±5.20 mmol/L，实验组FBG水平较对照组明显升高(P=0.003)(Tablel，Fig.1)。
　　2实验结束时(14周末)，各组大鼠生化指标
　　2.1三组大鼠血糖水平
　　糖尿病组FBG12.99±2.07 mmol/L，二甲双胍组FBG9.03±1.49mmol/L，均明显高于对照组FBG6.33±0.69 mmol/L(P＜0.05);二甲双胍组FBG较糖尿病组明显下降(P＜0.05);糖尿病组葡萄糖曲线下面积AUCg(34.34±7.63 mmol·L-1·h)，二甲双胍组AUCg(32.38±6.65mmol·L-1·h)，均高于对照组AUCg(18.72±3.27 mmol·L-1·h)(P=0.001)，但糖尿病和二甲双胍组间无明显差异(P＞0.05)(Table2，Fig.2，3)。
　　2.2三组大鼠胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、胰岛素分泌指数间的比较
　　糖尿病组空腹胰岛素(Fasting insulin，FINS)20.00±5.91 mIU/L，明显高于对照组（11.34±3.88 mIU/L）和二甲双胍组FINS水平(13.61±7.60mIU/L)，差异具有统计学意义(P=0.049)，而对照组和二甲双胍组间FINS水平无明显差异;对照组胰岛素曲线下面积AUCi(47.55±5.23 mIU·L-1·h)，明显高于二甲双胍组(32.78±11.64 mIU·L-1·h)和糖尿病组(30.78±11.25mIU·L-1·h)(P=0.006)，糖尿病和二甲双胍组间AUCi无明显差异(P＞0.05);糖尿病组HOMA-IR（11.20±2.22）明显高于对照组（3.13±0.88）和二甲双胍组（5.67±3.73）(P＜0.05)，对照组和二甲双胍组组间HOMA-IR无明显差异（P＞0.05）;三组间HOMA-β无明显差异（P＞0.05）（Table2，Fig.4，5，6）。
　　2.3三组大鼠血清生化指标
　　对照组:TG0.81±0.27 mmol/L,TC2.18±0.39 mmol/L,LDL-C1.24±0.47 mmolL，HDL1.55±0.33 mmol/L，ICAM-175.63±19.52 pg/ml, VCAM-1616.54±54.51 ng/ml, NF-κB78.68±12.15μmol/L
　　糖尿病组:TG1.83±0.40 mmol/L，TC4.15±0.41 mmol/L，LDL-C2.53±0.44 mmol/L，HDL0.68±0.23 mmol/L,ICAM-1130.59±16.00 pg/ml, VCAM-1990.19±119.18 ng/ml, NF-κB170.22±21.53μmol/L
　　二甲双胍组:TG1.33±0.30 mmol/L，TC3.21±0.46 mmol/L，LDL-C2.24±0.31 mmol/L, HDL-C0.98±0.34 mmol/L, ICAM-1102.86±15.76 pg/ml,VCAM-1860.66±112.72 ng/ml,NF-κB110.86±26.89μmol/L
　　结果显示，糖尿病组和二甲双胍组大鼠TG, TC，LDL-C，ICAM-1，VCAM-1，NF-κB水平均明显高于对照组(P＜0.05)，二甲双胍组TG、TC，ICAM-1，VCAM-1，NF-κB水平低于糖尿病组(P＜0.05)，二甲双胍组LDL-C水平较糖尿病组稍有下降，但差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组相比，糖尿病组和二甲双胍组HDL-C水平显著降低(P＜0.05)，但糖尿病和二甲双胍组组间HDL-C水平无明显差异(P＞0.05)(Table2-3，Fig.7-10)。
　　3胸主动脉病理改变
　　胸主动脉HE染色结果:血管组织切片HE染色后光镜下检查，对照组血管壁结构清晰，内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐，内皮细胞结构完整，中层及外膜结构清楚，未见病理性改变;糖尿病组可见血管壁弥漫性隆起，突向管腔面，内膜明显增厚，内膜下平滑肌细胞排列紊乱、增生，内有脂质沉积，形成大小不等、形态不规则的泡沫细胞，胶原纤维和弹性纤维增多;应用二甲双胍治疗后，胸主动脉血管壁无明显隆起，平滑肌细胞排列较整齐(Fig.11-13)。
　　4免疫组化结果:和对照组相比，糖尿病组和二甲双胍组大鼠胸主动脉中p-p38MAPK，NF-κB，MCP-1蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);和糖尿病组相比，二甲双胍组大鼠胸主动脉中p-p38MAPK，NF-κB，MCP-1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)(Table4，Fig.14-16)。
　　结论:
　　1磷酸化p38MAPK参与了糖尿病大血管病变的发生，因此，通过干预p38MAPK信号转导通路中的某些环节可缓解糖尿病大血管病变的发生、发展。
　　2二甲双胍除降糖作用外，还可通过下调血管p38MAPK磷酸化水平、抑制炎症反应、调节脂代谢，发挥对糖尿病大血管的保护作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 免疫组化染色结果判定

4 统计分析

结果

1 各组大鼠一般情况

2 实验6周末数据

3 实验结束时，各组大鼠生化指标

4 胸主动脉病理改变

5 免疫组化结果

附图

附表

讨论

1 糖尿病大血管病变

2 p38MAPK与糖尿病大血管病变的关系

3 二甲双胍对糖尿病大血管的影响

结论

参考文献

综述 二甲双胍对2型糖尿病大血管病变的保护作用机制

致谢

个人简历