乌司他丁通过上调HO-1抑制IL-4介导的肥大细胞活化

摘要

目的:近期我们研究发现既往主要应用于治疗感染中毒性休克、急性肺损伤等感染性炎性疾病的药物乌司他丁在卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠变应性炎症模型中具有免疫调节和抗氧化作用，同时还发现其免疫调节、抗氧化作用与血红素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1密切相关。
　　乌司他丁(Ulinastatin，UTI)是一种高效广谱的水解酶抑制剂，感染性炎症以中性粒细胞介导为主，而变应性炎症以嗜酸性粒细胞、肥大细胞等免疫细胞介导为主，二者的作用机制截然不同。因此进一步深入明确UTI在变应性炎症中的药理作用机制，为其转化为治疗变应性炎症的辅助用药提供实验室依据。HO-1属于微粒体催化酶，是体内免疫调节和抗氧化的重要调控因子。前期实验我们发现，乌司他丁在体内实验模型中发挥免疫调节、抗氧化作用与HO-1密切相关，乌司他丁是否是通过调控HO-1以及是通过何种信号通路来调控HO-1发挥免疫调节、抗氧化作用的机制需要在体外细胞实验模型中进一步探讨。
　　肥大细胞是介导变应性炎症的免疫细胞之一，变应性炎症的病理变化主要表现为肥大细胞活化脱颗粒，进而释放大量炎性介质。许多研究证明Th1/Th2细胞因子失衡是气道变态反应性炎症疾病发病机制的主要原因之一。因此实验选取Th2的代表因子IL-4作为刺激因素，它可以刺激B细胞增殖，从而产生大量的IgE抗体，导致肥大细胞活化。因此，本课题选用IL-4刺激肥大细胞活化，建立体外细胞实验模型对乌司他丁发挥免疫调节、抗氧化的药理作用机制进行深入探讨。
　　方法:肥大细胞（P815细胞株，购买自美国）培养于1640培养基中，其中含有10％新生牛血清，根据实验设计分组:空白对照组（Con组）、IL-4刺激组、乌司他丁干预组（UTI+IL-4组）、Znpp干预组(Znpp+UTI+IL-4组)。通过检测类胰蛋白酶活力及Th1/Th2细胞因子（IL-5、IL-13、TNF-α、INF-γ）水平从免疫调节角度验证乌司他丁是否能够抑制IL-4介导的肥大细胞活化;通过检测活性自由氧(ROS)、蛋白质羟基含量水平、丙二醛(MDA)及抗氧化酶指标:总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、微量还原性谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平从氧化应激角度验证乌司他丁是否能够调节IL-4介导的肥大细胞活化引起的氧化/抗氧化失衡;应用血红素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)-1的抑制剂Znpp验证乌司他丁是否通过调节HO-1来发挥免疫调节、抗氧化作用;通过电泳迁移率(EMSA)、WesternBlot等方法检测HO-1的上游调控因子Nrf2及相关信号通路探讨乌司他丁调节HO-1表达的具体机制。
　　结果:
　　1.IL-4、UTI的最适干预时间和浓度通过MTT法及类胰蛋白酶活力实验确定IL-4的最适宜浓度及干预时间分别为100ng/ml、6h;通过MTT法及UTI诱导HO-1蛋白水平的表达确定UTI的最适宜浓度及干预时间分别为100U/ml、2h。
　　2.Znpp抑制HO-1在肥大细胞中的表达肥大细胞在给予HO-1的抑制剂Znpp干预后，HO-1的表达无论是在细胞免疫荧光水平，还是在蛋白表达水平都有明显减弱趋势，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.UTI抑制IL-4介导的肥大细胞脱颗粒IL-4刺激肥大细胞后，类胰蛋白酶活力明显增强，高于空白对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05); UTI能够明显降低类胰蛋白酶活力，抑制肥大细胞活化状态，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.UTI调节IL-4介导肥大细胞活化引起的Th1/Th2细胞因子失衡Th1代表因子IL-5、IL-13、TNF-α的表达在IL-4刺激组明显高于空白对照组，Th2代表因子INF-γ的表达明显低于空白对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05); UTI明显抑制IL-5、IL-13、TNF-α的表达，提高INF-γ的表达，从而调节IL-4介导肥大细胞活化引起的Th1/Th2细胞因子失衡，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.UTI调节IL-4介导肥大细胞活化引起的氧化/抗氧化失衡在空白对照组中，活性自由氧(ROS)、蛋白质羟基含量及丙二醛(MDA)处于低水平;给予IL-4刺激后，三个氧化应激损伤指标表达明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，抗氧化酶(T-AOC、SOD、CAT、GSH、 GSH-Px)水平明显下调，差异具有统计学意义(P＜0.05);当给予UTI干预后，ROS、蛋白质羟基含量及MDA水平明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，抗氧化酶(T-AOC、SOD、CAT、GSH、GSH-Px)水平明显升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.UTI诱导HO-1蛋白水平的表达，呈现时间及剂量依赖性在一定时间或浓度范围内，随着UTI干预时间的延长或浓度的增加，HO-1蛋白水平表达呈现明显增加趋势，存在时间及剂量依赖关系，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　7.UTI诱导Nrf2核转移随着UTI干预时间的延长，Nrf2在胞浆中的表达逐渐降低，在胞核中的表达逐渐增强，存在Nrf2从胞浆向胞核转移的趋势，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　8.UTI增强Nrf2与ARE的结合活性电泳迁移率检测(EMSA)实验结果显示:随着UTI干预时间的延长，Nrf2与ARE结合活性明显增强。
　　9.UTI激活P38MAPK/Nrf2信号通路调节HO-1表达Western Blot结果显示:随着UTI干预时间的延长，UTI能够增强磷酸化的P38蛋白表达水平，而磷酸化的JNK、ERK蛋白表达水平均无明显差异性;当实验中分别加入P38的抑制剂(SB203580)，JNK的抑制剂(SP600125)以及ERK的抑制剂(PD98059)后，HO-1表达能被P38的抑制剂(SB203580)所抑制，而JNK及ERK的抑制剂对HO-1表达均无明显作用，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.乌司他丁在IL-4介导的肥大细胞活化中具有显著的免疫调节、抗氧化作用。
　　2.乌司他丁通过诱导HO-1表达发挥免疫调节、抗氧化作用。
　　3.乌司他丁通过P38MAPK/Nrf2信号通路实现了对HO-1表达的调控。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 IL-4、UTI最适浓度及干预时间确定

2 Znpp抑制HO-1在肥大细胞中的表达

3 UTI抑制IL-4介导的肥大细胞脱颗粒

4 UTI调节IL-4介导肥大细胞活化引起的Th1／Th2细胞因子失衡

5 UTI调节IL-4介导肥大细胞活化引起的氧化／抗氧化失衡

6 UTI诱导HO-1蛋白水平的表达，呈现时间及剂量依赖性

7 UTI诱导Nrf2核转移

8 UTI增强Nrf2与ARE的结合活性

9 UTI激活P38MAPK／Nrf2信号通路调节HO-1表达

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 血红素氧合酶-1及代谢产物生物学功能的研究进展

致谢

个人简历