云泛素化酶USP26基因的2个无义突变及6个借义突变对其酶活性的影响

摘要

目的:泛素特异性蛋白酶基因Usp26位于Xq26.2，其mRNA含2794个碱基对，可编码913个氨基酸，USP26蛋白预期分子量为104 KDa。研究发现X染色体上存在许多可导致雄性不育的异常基因，其中就包括特异性表达于睾丸组织中的Usp6基因。2005年Stouffs等首次报道了Usp26基因突变与精子生成障碍的相关性，随后一些研究也先后提出Usp26基因突变会引起男性不育。但另外一些研究认为Usp26基因突变可能与精子生成障碍无关。然而，上述研究大部分为观察性研究，且USP26蛋白的功能也不十分清楚。本研究的目的是从分子水平研究分析野生型和突变型USP26蛋白的酶活性功能，以便了解Usp26基因突变的生物学意义。目前，有文献报道的Usp26基因突变有23个，其中有15个突变位点本课题组已成功构建并检测了其对泛素特异性蛋白酶USP26活性的影响发现这些位点突变并未影响USP26的去泛素化酶活性，认为Usp26基因中这15个突变位点可能与男性不育症并不相关。为了确证剩余8个突变位点(520 G＞T、565 G＞T、1037 T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)是否影响USP26的活性，本研究构建了这8个突变位点的表达质粒，采用已建立的去泛素化酶活性检测体系检测了各突变位点对USP26酶活性的影响，为进一步了解Usp26基因突变在男性不育中的作用奠定分子基础。
　　方法:
　　1构建pGEX-Usp26各种突变质粒。以本室保存的pGEX-Usp26 WT为模板，采用定点突变的方法构建2个无义突变(520 G＞T、565 G＞T)及6个错义突变(1037 T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)的重组质粒，并用限制性内切酶酶切法和DNA测序法鉴定突变型重组质粒。
　　2构建pAC-T7-Usp26各突变质粒。采用限制性内切酶BamHⅠ从已构建的pGEX-Usp26各突变质粒中切出Usp6基因目的片段，将其克隆到pAC-T7载体质粒，以构建pAC-T7-Usp26各突变质粒，并用SalⅠ和PstⅠ酶切鉴定。
　　3采用Ub-Met-β-gal和GST-Ub52两种不同的模型底物对各突变型USP进行去泛素化酶活性分析，底物蛋白检测采用Western Blot法，利用Odyssey双色红外激光成像系统扫描观察结果。
　　结果:
　　1 pGEX-Usp26突变质粒的构建:测序证实，质粒中所插入的2742 bp片段为人类基因Usp26的编码区，其相应位点突变得到了证实这些突变导致的氨基酸变化分别是:E174X（X:终止密码子）(520 G＞T)、E189X(565 G＞T)、L346H(1037 T＞A)、E500K(1498 G＞A)、P517S(1549C＞T)、Q537E(1609 C＞G) I728F(2182 A＞T)以及F732S(2195 T＞C)。
　　2采用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ酶切鉴定构建的pAC-T7-Usp26各突变质粒，均可产生大小分别为1.5 Kb和5.7 Kb的两个片段，故成功构建了pAC-T7-Usp26各突变质粒。
　　3错义突变(1037T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)对酶活性的影响:这6种突变型与USP26野生型一样，均能使模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52去泛素化，即各位点突变均不影响USP26的去泛素化酶活性。
　　4无义突变520 G＞T和565 G＞T仍均能使模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52去泛素化，未影响USP26的去泛素化酶活性。理论上2个无义突变分别只能编码Usp26的520个碱基和565个碱基（均不包括去泛素化酶活性中心），产生的蛋白应不再具有去泛素化酶活性。实际结果与理论相反的可能原因是在大肠埃希菌等某些原核生物中即便编码过程中有终止密码子，若其后仍有起始密码子-ATG-，则仍可跨越终止密码子继续向下编码。
　　5构建无义突变520* G＞T(522 bp)、565* G＞T(567 bp)，发现两个突变型均不能去泛素化模型底物Ub-Met-β-gal及GST-Ub52，进一步验证了520 G＞T、565 G＞T位点突变若引起转录终止，则均可导致USP26去泛素化酶活性消失。
　　结论:
　　1成功构建了Usp26的2个无义突变(520 G＞T、565 G＞T)及6个错义突变(1037 T＞A、1498 G＞A、1549 C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195 T＞C)的重组质粒。
　　2去泛素化酶USP26的6个错义突变:1037 T＞A、1498 G＞A、1549C＞T、1609 C＞G、2182 A＞T和2195T＞C均未影响USP26的去泛素化酶活性。
　　3由于受限于原核生物表达系统，无义突变520 G＞T和565 G＞T同样未影响USP26的活性。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 仪器和设备

3 试剂

4．方法

结果

1 Usp26突变质粒的构建

2 去泛素化酶USP26突变型的酶活性分析

3 构建Usp26基因的520*G>T(*表示目的片段仅为522 bp)和565*G>T(*表示目的片段仅为567 bp)无义突变型重组质粒

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 常见基因多态性与精子生成异常

致谢

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