雷帕霉素对K562细胞P13K/AKT/mTOR通路的影响及其作用机制

摘要

目的:雷帕霉素是一种大环内酯类免疫抑制剂，具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制侵袭、抑制血管生成等作用。雷帕霉素的主要作用机制是与免疫亲和蛋白(FKBP12)结合形成RAPA-FKBP12复合物，作用于哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)上从而阻断细胞信号传导，从而减少其下游分子4EBP-1、P70S6KB的表达，进而影响细胞周期和蛋白的合成以促进细胞凋亡并抑制肿瘤细胞的增殖，并且通过抑制VEGF、HIF1α的表达抑制血管新生和降低肿瘤细胞的侵袭性及转移。
　　慢性粒细胞白血病是一种骨髓增殖性肿瘤，95％的CML患者具有BCR/ABL融合基因阳性。虽然TKIs应用使CML的治疗取得了重大的突破，但其存在耐药问题，因此需要寻找其他的治疗方法。
　　本实验拟在研究雷帕霉素对K562细胞的PI3K/AKT/mTOR途径的下游分子4EBP1、P70S6KB、VEGF、HIF1α的影响，及通过电镜了解应用雷帕霉素后K562细胞形态学的变化，并通过酶组织化学染色了解雷帕霉素对K562细胞溶酶体及线粒体的影响。为雷帕霉素治疗慢性粒细胞白血病提供理论基础和依据。
　　方法:体外培养K562细胞，在不同浓度雷帕霉素中干预24h，应用CCK8法检测雷帕霉素对K562细胞的抑制作用。根据CCK8的检测结果分别选取0nmol/L、80nmol/L、160nmol/L、320nmol/L浓度的雷帕霉素处理K562细胞24h，后采用Western Blot方法检测4EBP1、VEGF分子的表达情况，采用RT-PCR方法检测PI3K/AKT/mTOR途径的下游分子4EBP1、P70S6KB、VEGF、HIF1α的表达情况及BCR/ABL和SHIP的表达情况;应用电镜及NADH染色、酸性磷酸酶(ACP)染色了解雷帕霉素对K562细胞形态学及线粒体、溶酶体的影响。
　　结果:
　　1.随着雷帕霉素浓度的增高对K562细胞的抑制率明显上升(P＜0.05）。
　　2.随着雷帕霉素浓度增高4EBP1、VEGF在蛋白水平的表达降低(P＜0.05)。
　　3.随着雷帕霉素浓度的增高4EBP1、P70S6BK、VEGF、HIF1α分子在mRNA水平表达明显降低(P＜0.05)。
　　4.随着雷帕霉素浓度的增高细胞在电镜下出现的凋亡程度加重，在酶组织化学染色显示对溶酶体及线粒体细胞损伤加重。
　　5.雷帕霉素对SHIP基因和BCR/ABL融合基因(P＞0.05）无明显作用。
　　结论:
　　1.雷帕霉素可以抑制K562细胞的生长，促进K562细胞凋亡。
　　2.雷帕霉素通过抑制mTOR而降低其下游分子4EBP1、P70S6BK、VEGF、HIF1α的表达而达到抑制蛋白合成和基因的表达而达到抗肿瘤作用。
　　3.雷帕霉素可以通过损伤线粒体和溶酶体而使细胞发生凋亡和坏死。
　　4.雷帕霉素不能通过影响SHIP基因和BCR/ABL融合基因而影响K562细胞的生长。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学分析

结果

1 雷帕霉素对K562细胞抑制率的影响

2 雷帕霉素对K562细胞溶酶体的影响

3 雷帕霉素对K562细胞线粒体的影响

4 雷帕霉素对K562细胞形态学的影响

5 雷帕霉素对K562细胞PI3k／AKT／mTOR途径下游蛋白4EBP-1及VEGF的影响

6 雷帕霉素对K562细胞4EBP-1、P70S6KB、HIF-α、VEGF、SHIP、BCR／ABL的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 慢性粒细胞白血病治疗

致谢

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