α-硫辛酸对杏仁核电点燃慢性癫痫大鼠海马CaMKIIa表达的影响

摘要

目的:癫痫是指神经元自发的，反复的，刻板的放电发作。癫痫可以导致认知、情感、行为方面异常。癫痫病灶部位、发作类型及社会心理因素均可影响认知，近几年研究发现抗癫痫药物本身也有导致认知损伤的副作用。氧化应激参与了许多神经变性疾病的生理病理过程，近来研究发现氧化应激同样存在于癫痫的发病机制之中。癫痫发作过程伴有氧自由基生成增多，大脑是脂质过氧化物敏感的器官，其中海马神经元氧化应激损伤是癫痫大鼠认知功能障碍发生、发展的重要因素之一。α-硫辛酸(α-LipoicacidALA)是一种体内强抗氧化剂，具有潜在的预防和治疗癫痫所致认知功能障碍的作用。目前α-硫辛酸多用于用来预防甚至治疗某些疾病如:糖尿病及其并发症、神经系统退化及肝功能失调等症状。而α-硫辛酸在改善癫痫所致的认知障碍中的作用尚未见报道。本实验通过建立杏仁核电点燃慢性癫痫大鼠模型，并给予α-硫辛酸干预，用WesternBlot方法观察钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱa(calciurn/calmodulindependentproteinkinaseⅡa，CaMKⅡa)及磷酸化钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMKⅡa)蛋白在海马组织中的表达水平，用免疫组织化学方法观察磷酸化钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMKⅡa)在大鼠海马组织中的蛋白表达水平及分布情况，用Nissl染色方法观察大鼠海马组织的形态学情况，并用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力。初步探讨α-硫辛酸对癫痫认知障碍有无神经保护作用及其可能的作用机制。
　　方法:将72只7-8周，体重250-300g之间，成年雄性Wistar大鼠随机分为:正常对照组(NC组)、假手术组（S组）、癫痫组（E组）、正常α-硫辛酸组(ALA组)、α-硫辛酸低剂量组（20mg/kgALA+E组）和α-硫辛酸高剂量组（40mg/kgALA+E组），每组各12只大鼠。正常对照组:不做任何处理;假手术组:杏仁核植入电极;癫痫组:杏仁核植入电极后每天按120％发作阈值刺激一次;正常α-硫辛酸组:不做任何处理的大鼠硫辛酸按40mg/kg腹腔注射;α-硫辛酸低剂量组和α-硫辛酸高剂量组:于每天上午08:30-09:30之间分别腹腔注射α-硫辛酸20mg/kg和α-硫辛酸40mg/kg，药物注射完30min后，按120％发作阈值刺激1次/日，共15次。结束后观察1小时。依据Becker等改良的Racine分级标准观察:0级:无任何反应，呈正常的行为状态;1级:湿狗样抖动、面肌痉挛如眨眼、动须及节律性咀嚼;2级:颈部肌肉痉挛表现为点头和（或）甩尾;3级:一侧前肢阵挛;4级:双侧前肢阵挛伴站立;5级:全身阵挛，失去平衡，跌倒。连续3次获得Ⅳ级或Ⅳ级以上的运动性惊厥的大鼠为完全点燃。最后一次给药结束后24小时，行Morris水迷宫检测，实验前1天大鼠在水池内自由游泳2min，熟悉环境。实验包括(1)可视平台实验:为排除实验处理因素对动物实验感觉、视觉、知觉及运动功能的差异对空间学习记忆的影响，采用可视平台对大鼠进行测试。平台升至液面上2cm，每只大鼠释放4次，分别从不同的4个入水点入水，记录大鼠的逃避潜伏期。(2)定位航行实验:用于测试大鼠的学习能力。正式实验历时4天。以后4天每天分上、下午两个时间段，每段训练4次，中间间隔＞2h。训练时随机选取一个象限中心作为入水点，将大鼠面向池壁轻轻放入水中，每个时间段4次训练分别从4个不同的入水点入水。记录大鼠从入水到爬上水下平台的时间，即逃避潜伏期。如120s大鼠仍未找到平台，由操作者将大鼠引上平台休息30s，并将潜伏期记录为120s，两次训练中间间隔60s;(3)空间探索实验:用于测试大鼠的空间记忆能力。定位航行实验完毕的第二天，将平台撤除，选定和平台区域相对的象限中点为入水点，记录大鼠在120s内为搜寻平台而穿越平台的次数。行为学测试结束后:(1)每组各取6只大鼠灌注取脑，Nissl染色观察大鼠海马神经元细胞形态及损伤情况。同时用免疫组织化学方法检测P-CaMKⅡa在海马CA1区的表达情况;(2)每组另取6只大鼠，断头取脑，快速分离海马，用Westerblot方法检测海马CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白水平变化。
　　结果:
　　1、水迷宫结果:可视平台试验:NC组、ALA组、S组、E组大鼠、20mg/kgALA+E组及40mg/kgALA+E组之间比较逃避潜伏期无明显统计学差异（P＞0.05）。
　　定位航行实验:以各组大鼠每日逃避潜伏期均值进行比较。(1)第1天，E组大鼠的逃避潜伏期与NC组相比有所延长;与E组相比，20mg/kgALA+E组、40mg/kgALA+E组、ALA组、S组的逃避潜伏期均有所缩短，但各组间比较无统计学意义（P＞0.05）。(2)第2天，各组大鼠逃避潜伏期均比第1天明显缩短（P＜0.05）;E组大鼠的逃避潜伏期与NC组相比明显延长（P＜0.05）;与E组相比，20mg/kgALA+E组、40mg/kgALA+E组、ALA组、S组的逃避潜伏期均有所缩短（P＜0.05），但与NC组比较无统计学意义(P＞0.05)。(3)第3天，各组大鼠逃避潜伏期均比第2天明显缩短(P＜0.05);NC组、E组、20mg/kgALA+E组、40mg/kgALA+E组、ALA组、S组的逃避潜伏期相互比较结果与第2天相同。(3)第4天，各组大鼠逃避潜伏期均比第3天又有明显缩短(P＜0.05);NC组、E组、20mg/kgALA+E组、40mg/kgALA+E组、ALA组、S组的逃避潜伏期相互比较结果与第3天相同。
　　空间探索试验:E组大鼠与NC组大鼠相比，穿越平台次数明显减少(p＜0.05);与E组相比，20mg/kgALA+E组及40mg/kgALA+E组穿越平台次数明显增多(p＜0.05)，且与NC组、ALA组、S组比较无明显统计学意义(p＞0.05)。
　　2、Nissl染色结果:NC组、ALA组及S组大鼠的海马神经元结构完整，细胞浆内尼氏小体丰富，染色质分布均匀，核仁清晰，无明显神经元丢失;与NC组相比，E组大鼠海马细胞皱缩，胞浆内尼氏小体明显减少，染色质凝集成块、核固缩、神经元丢失明显;20mg/kgALA+E组及40mg/kgALA+E组海马神经元结构正常，有少量染色质凝集，胞浆内尼氏小体较E组显著增加，仅少量神经元丢失。
　　3、免疫组化结果:P-CaMKⅡa蛋白在海马组织中的阳性细胞显示为棕褐色，主要在细胞的胞浆内表达。E组的P-CaMKⅡa在海马表达的阳性细胞数较NC组明显降低（P＜0.05）。与E组比较，20mg/kgALA+E组和40mg/kgALA+E组的P-CaMKⅡa蛋白在海马表达的阳性细胞数明显升高（P＜0.05）。且20mg/kgALA+E组及40mg/kgALA+E组与NC组、ALA组、S组之间比较无明显统计学差异（P＞0.05）。
　　4、Westernblot检测结果:CaMKⅡa蛋白在各组大鼠海马表达水平以CaMKⅡa/GAPDH表示。E组CaMKⅡa蛋白表达水平较NC组明显降低(P＜0.05)。20mg/kgALA+E组和40mg/kgALA+E组的CaMKⅡa蛋白表达水平较E组明显升高（P＜0.05）。S组、NC组、ALA组、20mg/kgALA组+E组及40mg/kgALA组+E组之间比较无统计学意义(P＞0.05)。
　　P-CaMKⅡa蛋白在各组大鼠海马表达水平以P-CaMKⅡa/GAPDH表示。E组P-CaMKⅡa蛋白表达水平较NC组明显降低（P＜0.05）。20mg/kALA+E组和40mg/kgALA+E组的P-CaMKⅡa蛋白表达水平较E组明显升高（P＜0.05）。S组、NC组、ALA组、20mg/kgALA组+E组及40mg/kgALA组+E组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论:
　　1、本实验采用杏仁核电点燃慢性癫痫大鼠模型可以很好地模拟人类癫痫后认知功能障碍，是研究癫痫后认知障碍的理想模型。
　　2、癫痫可导致CaMKⅡa和P-CaMKⅡa蛋白表达下降，并导致脑组织受损，提示CaMKⅡa及P-CaMKⅡa可能与癫痫后认知障碍相关。
　　3、α-硫辛酸可以上调癫痫后海马组织中CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白的表达水平，改善癫痫后认知障碍，并减轻脑组织的损害，提示α-硫辛酸可改善癫痫后认知障碍并对脑组织有一定保护作用，这种作用可能是通过调节CaMKⅡa及P-CaMKⅡa蛋白活性及抗氧化应激作用来实现的。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 水迷宫结果

2 Nissl染色结果

3 磷酸化钙／钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱa(P-CaMK Ⅱa)免疫组化结果

4 Western blot结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 CaMKⅡ与癫痫及认知的关系

致谢

个人简历