血管紧张素Ⅱ对体外培养人牙髓细胞生物学特性影响的实验研究

摘要

目的:通过组织块酶消化法进行人牙髓细胞的原代培养以获得大量可供实验用的牙髓细胞，建立人牙髓细胞的体外研究模型。研究不同浓度的AngⅡ对体外培养人牙髓细胞增殖效应、细胞周期进程、迁移等一系列生物学活性的影响。
　　方怯:
　　1.选取符合纳入标准的新鲜拔除健康牙（均经患者知情同意），在无菌条件下拔出牙髓组织，通过组织块酶消化法进行牙髓细胞的原代培养，显微镜下观察组织块的解离情况，细胞的形态学表现和生长状态，待细胞生长融合达80％铺满瓶底后，用0.25％胰酶消化按1∶1进行细胞首次传代，以后传代按1∶3比例进行，取生长状况良好的第4代人牙髓细胞，胰酶消化后制备成细胞悬液进行细胞爬片，用SABC法进行波形蛋白和角蛋白免疫组化染色鉴定细胞来源。HE染色观察细胞的组织学形态。
　　2.取生长状态良好的第4代人牙髓细胞，0.25％胰酶消化，用含15％胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，调整细胞悬液的浓度为2×104个/ml，接种于96孔板，每孔加液量200μL。随机分为五个实验组和一个对照组，每组复五孔。恒温培养箱内培养24h，弃孔内原培养液，PBS缓冲液冲洗3遍。在相应实验组的孔内加入200μL含5％胎牛血清的DMEM培养液配制的AngⅡ溶液(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)，对照组加入等量的含5％胎牛血清的DMEM培养液。放入培养箱内继续培养，于24h、48h、72h各取出一块96孔板，加入CCK-8溶液，37℃恒温培养箱内孵育2h，酶标仪上450nm波长处测各孔吸光度值（OD值）。
　　3.取生长状态良好的第4代人牙髓细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，1000r/min离心5min，弃上清液，加完全培养液重悬细胞，调整细胞悬液的浓度为2×104个/ml，接种在25ml的培养瓶中，每瓶加液量3ml。随机分为两组，每组复三瓶，培养箱中培养24h。弃瓶内原培养液，PBS缓冲液冲洗3遍，实验组相应的瓶内加入3ml含5％胎牛血清DMEM培养液配制的10-7mol/L AngⅡ溶液，对照组加入等量含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养牙髓细胞48h，消化，离心，收集细胞，加入-20℃预冷70％的乙醇，4℃过夜固定样本，按照细胞周期试剂盒说明书操作，应用流式细胞仪检测分析AngⅡ对牙髓细胞的DNA合成，细胞周期进程的影响。
　　4.Transwell迁移实验。取生长良好的第4代人牙髓细胞，0.25％胰蛋白酶消化，1000r/min离心5min，弃上清液，用完全培养液重悬细胞制备成浓度为1×106个/ml的细胞悬液，以每孔100μL加液量接种于Transwell小室的上室内。恒温培养箱内培养24h，显微镜下观察到细胞贴壁状态良好后，换用含1％胎牛血清的DMEM培养液培养牙髓细胞24h进行细胞周期同步化处理，弃原孔内培养液，DMEM培养液冲洗，随机分为五个实验组和一个对照组。实验组及对照组所有孔的上室内均加入100μL不含血清的DMEM培养液，实验组下室内加入600μL DMEM培养液配制的不同浓度（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L）的AngⅡ溶液，对照组下室内加入等量DMEM培养液，继续培养24h。显微镜下观察细胞生长状况，下室内有无牙髓细胞。用眼科镊取出Transwell小室，棉签轻轻拭去小室滤膜内表面的牙髓细胞，37℃ PBS浸洗，70％酒精固定，结晶紫染色，显微镜下观察并计数各组的穿膜细胞数。
　　结果:
　　1.通过组织块酶消化法进行牙髓细胞的原代培养所获得的细胞形态均一为典型的梭性，胞体丰满，胞浆丰富，圆形或椭圆形的细胞核位于细胞中央。免疫组织化学染色结果示波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性。符合牙髓细胞组织学表现。
　　2.与对照组相比，一定浓度范围内（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的AngⅡ均能促进体外培养的人牙髓细胞的增殖效应。且在这一浓度范围内，AngⅡ对牙髓细胞的促增殖作用呈现浓度依赖性。与对照组相比，AngⅡ可促进细胞DNA合成，推进牙髓细胞的细胞周期进程(P＜0.05)。
　　3.与对照组相比，在一定浓度范围内（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L）的AngⅡ均能促进体外培养的人牙髓细胞的迁移作用。且在该浓度范围内，AngⅡ对牙髓细胞的促迁移作用呈浓度依赖性(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.采用组织块酶消化法可成功培养出牙髓细胞，培养所得的细胞形态学表现，组织来源鉴定结果等均符合人牙髓细胞生物学特性。
　　2.一定浓度范围内，AngⅡ可促进人牙髓细胞的细胞增殖效应，促进有丝分裂和DNA合成，推进细胞周期进程;AngⅡ可作为趋化因子促进人牙髓细胞的迁移作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 人牙髓细胞的原代培养及细胞传代

2 细胞来源鉴定及形态学观察

3 应用CCK-8法检测不同浓度的AngⅡ对人牙髓细胞增殖的影响

4 10-7mol／L AngⅡ对人牙髓细胞细胞周期的影响

5 不同浓度AngⅡ对人牙髓细胞迁移的影响

附图

附表

讨论

1 人牙髓细胞的培养与鉴定

2 AngⅡ对HDPCs生物学特性的影响

结论

参考文献

综述 与牙髓干细胞迁移相关趋化因子的研究现状

致谢

个人简历