PGP9.5、NGF在实验性小鼠子宫内膜异位症的表达及补肾温阳化瘀方对其影响

摘要

目的:子宫内膜异位症(Endometriosis，EMs)，简称内异症，是妇科常见病和多发病。临床多以痛经、不孕、盆腔痛为主症。内异症疼痛严重影响患者的生活质量。已知前列腺素与妇科疼痛的关系密切，近年的研究发现内异症疼痛的发生与神经纤维增生密切相关。本研究通过实验动物模型分析神经标记物蛋白基因产物PGP9.5(Protein gene Product9.5，PGP9.5)、神经生长因子NGF(never growth factor, NGF)、前列腺素E2(ProstaglandinE2，PGE2)在内异症子宫内膜组织中的表达，以探讨内异症疼痛发生的部分机制;并对实验性小鼠采用补肾温阳化瘀方进行治疗，探讨补肾温阳化瘀法治疗内异症疼痛的作用机制。
　　方法:选用健康清洁级6～8周龄近交系BALB/c小鼠80只，体重20±2g，术前两天以补佳乐0.5mg/kg灌胃，使手术时小鼠处于统一动情期（阴道涂片为大量无核角化细胞）。随机取65只小鼠参考王艳萍方法复制内异症模型，另外15只作为假手术组。将成功复制的内异症模型的小鼠60只，随机分为4组:模型组;补肾温阳化瘀方高剂量组(61.67g/kg，相当于临床用量20倍)，简称（“高剂量组”）;中药低剂量组(15.42g/kg，相当于临床用量5倍)，简称（“低剂量组”）;孕三烯酮组(0.42mg/kg，相当于临床用量10倍)。假手术组正常清洁饲养。
　　术后1～12天采用补佳乐(0.5mg/kg)联合缩宫素(2U/只)建立痛经模型，同时给药。给药方案如下:假手术组给予纯净水灌胃1ml/100g，每日2次;模型组:上午纯净水灌胃1ml/100g，下午灌胃补佳乐;高剂量组:上午灌胃6.17g/ml浓缩液，下午灌胃补佳乐;低剂量组:上午灌胃1.54g/ml浓缩液，下午灌胃补佳乐;孕三烯酮组:每周2次上午灌胃孕三烯酮混悬液，其余时间上午给予纯净水灌胃，每天下午灌胃补佳乐;第12天末次给补佳乐后1小时，腹腔注射缩宫素2U/只(0.2ml)，诱发扭体反应，假手术组腹腔注射生理盐水0.2ml/只。扭体观察半小时，结束后断头处死，无菌操作剖腹取出异位内膜组织、在位子宫内膜组织，假手术组取子宫内膜组织，部分组织用4％多聚甲醛固定用于免疫组织化学染色，部分组织立即置于液氮中后转入-80℃冰箱用于Western-blotting及Real time PCR检测，部分组织匀浆取上清液用于酶联免疫法检测。
　　结果:
　　1扭体反应
　　除假手术组外，各组均发生扭体反应，扭体发生率100％。高剂量组、低剂量组、孕三烯酮组扭体潜伏期明显延长，与模型组相比，差异有统计学意义(均为P＜0.01)，扭体次数显著减少，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，各治疗组之间差异无统计学意义（均为P＞0.05）。
　　2 PGP9.5表达
　　2.1免疫组化法检测PGP9.5蛋白表达
　　异位内膜表达:PGP9.5蛋白阳性主要表达于异位内膜间质细胞的胞浆中。模型组PGP9.5蛋白表达高于各治疗组（均P＜0.05）。PGP9.5蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　在位子宫内膜:PGP9.5蛋白阳性主要表达于在位内膜腺体细胞的胞浆中。模型组PGP9.5蛋白表达高于假手术组(P＜0.01); PGP9.5蛋白在高剂量组、低剂量组表达高于假手术组(P＜0.05）;在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2.2 Western-blotting检测PGP9.5蛋白表达
　　异位内膜表达:模型组PGP9.5蛋白表达高于各治疗组（均P＜0.01）。PGP9.5蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　在位子宫内膜:模型组PGP9.5蛋白表达高于假手术组(P＜0.01);PGP9.5蛋白在高剂量组、低剂量组的表达高于假手术组(P＜0.05);PGP9.5蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2.3 Real time PCR检测PGP9.5 mRNA的表达
　　异位内膜表达:模型组PGP9.5 mRNA的表达高于各治疗组（均P＜0.01）。PGP9.5 mRNA在高剂量组表达低于孕三烯酮组(P＜0.05);低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P＞0.05);高剂量组低于低剂量组（P＜0.05）。
　　在位子宫内膜:模型组PGP9.5 mRNA表达高于假手术组(P＜0.01)。 PGP9.5 mRNA在高剂量组、低剂量组表达高于假手术组(P＜0.05);PGP9.5mRNA在高剂量组的表达低于孕三烯酮组(P＜0.01）;低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P＞0.05）;高剂量组低于低剂量组（P＜0.01）。
　　3 NGF的表达
　　3.1免疫组化法检测NGF蛋白表达（均P＜0.01）
　　异位内膜:NGF蛋白阳性主要表达于异位内膜间质细胞的胞浆中。模型组NGF蛋白表达高于各治疗组（均P＜0.01）;NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　在位子宫内膜:NGF蛋白阳性主要表达于在位内膜间质细胞的胞浆中。模型组NGF蛋白表达高于假手术组(P＜0.01);NGF蛋白在高剂量组、低剂量组表达高于假手术组(P＜0.05); NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3.2 Western-blotting检测NGF的表达
　　异位内膜:模型组NGF蛋白表达高于各治疗组（均P＜0.01）;NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　在位子宫内膜:模型组NGF蛋白表达高于假手术组（P＜0.01）;高剂量组、低剂量组与假手术组表达比较差异无统计学意义(P＞0.05); NGF蛋白在各治疗组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　3.3 Real time PCR检测NGF盼表达
　　异位内膜表达:模型组NGF mRNA表达高于各治疗组（均P＜0.01）。NGF mRNA在高剂量组表达低于孕三烯酮组(P＜0.01);低剂量组低于孕三烯酮组(P＜0.05);高剂量组低于低剂量组（P＜0.05）。
　　在位子宫内膜:模型组NGF mRNA的表达高于假手术组(P＜0.01)。NGF mRNA在高剂量组表达与假手术组比较差异无统计学意义(P＞0.05）;高剂量组低于孕三烯酮组(P＜0.01）;低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P＞0.05）;高剂量组低于低剂量组（P＜0.01）。
　　4酶联免疫法检测组织匀浆中PGE2的水平
　　异位内膜:模型组PGE2水平与各治疗组比较差异有统计学意义(均P＜0.01)。高剂量组PGE2水平低于孕三烯酮组(P＜0.05）;低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义(P＞0.05);高剂量组PGE2水平低于低剂量组(P＜0.01)。
　　在位子宫内膜:模型组PGE2水平高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.01）。高剂量组PGE2水平高于假手术组(P＜0.05);高剂量组低于孕三烯酮组（P＜0.05）;低剂量组与孕三烯酮组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;高剂量组低于低剂量组(P＜0.01)。
　　5 PGE2、PGP9.5、NGF的相关性:
　　异位内膜及在位子宫内膜PGE2、PGP9.5、NGF作直线相关性检验。PGE2与PGP9.5(r=0.755,P=0.0005;r=0.456,P=0.044); PGE2与NGF(r=0.747,P=0.0025;r=0.336,P=0.11)。NGF与PGP9.5(r=0.906,P＜0.01;r=0.964,P＜0.01)，呈显著正相关。
　　结论:
　　1行为学、大体标本、病理学三方面证实了子宫内膜异位症痛经模型的建立成功，可用于临床疾病的研究。
　　2 NGF、PGP9.5在内异症痛经模型的在位子宫内膜、异位内膜表达升高，且二者呈正相关关系。提示NGF促进神经纤维生长，局部神经纤维增生，参与内异症疼痛的发生。
　　3 PGE2在内异症痛经模型的在位子宫内膜、异位内膜组织中表达升高，PGE2与NGF、PGP9.5表达在异位内膜呈正相关。提示PGE2可能促进异位内膜中NGF表达，进而与局部神经增生有关。
　　4补肾温阳化瘀方可缩小移植内膜组织体积并具有镇痛作用。同时补肾温阳化瘀方可以降调内异症异位内膜及在位子宫内膜中升高的NGF、PGP9.5、PGE2表达，提示该法可通过调节病灶局部及在位子宫内膜NGF、PGP9.5、PGE2水平，起到治疗内异症疼痛的作用。该作用效果同孕三烯酮。

目录

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 子宫内膜异位症疼痛的中医药治疗

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