Na+，K+-ATP酶在稳定转染TDP-25的运动神经元样细胞中的作用

摘要

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种特异性累及运动神经元的神经变性疾病，可累及皮质、脊髓、脑干、脊髓束的运动神经元。在所有ALS患者中，90％为散发病例，其余10％为家族型。已有研究提出ALS病因可能与编码TDP-43的基因突变有关，且突变率随着年龄增长而增加，表明其它基因或环境因素可能会促进疾病的发展。
　　TDP-43是由TARDBP基因编码的多功能DNA-RNA结合蛋白，正常情况下只存在于细胞核内。在ALS和FTLD-U患者脑组织中，发现病理性TDP-43异常移位到细胞质并在此聚集，可形成不溶性的泛素化包涵体。病理性TDP-43可经蛋白酶水解裂开，形成分子量为25kDa的C末端片段，即TDP-25，仍具备易聚集性和细胞毒性。许多研究发现，TDP-43和TDP-25是许多神经变性疾病的显著病理学特征，例如FTLD-TDP和肌萎缩侧索硬化。ALS患者脑组织中TDP-25的产生和聚集，可能是神经元变性的重要原因。尽管推测TDP-25在神经元变性中起重要作用，但目前对此肽链的作用还不十分明确。Na+，K+-ATP酶是细胞生存的核心，对维持神经元细胞内外离子稳态、膜电位离子平衡及细胞的细胞膜兴奋性等许多生理过程具有重要的作用。当Na+，K+-ATP酶功能受到抑制时，Na+向胞外转运减少并在细胞内大量聚集，通过Na+/Ca2+交换体逆向转运，导致细胞内Ca2+升高，引起细胞的损伤乃至凋亡。Na+，K+-ATP酶在神经元中可表达α1、α3两种不同亚型的亚基，根据对哇巴因亲和力的不同，分为低亲和力结合亚基和高亲和结合亚基，在不同组织和不同发育阶段，不同亚型的α亚基发挥不同的作用。
　　已有证据表明ALS患者在发病早期还未出现临床表现时，就已出现皮质或脊髓运动神经元兴奋性异常增高。动物实验证实，转染突变SOD1基因的ALS小鼠在出现临床症状前就已出现脊髓运动神经元兴奋性升高。而SOD1作为第一个被发现的可引起ALS的突变基因，其活性的缺失被认为是ALS的致病机理之一。神经元兴奋性增高可增加ATP的消耗，加重线粒体负担，促进临床症状的进展。不仅如此，在ALS小鼠脊髓神经元中发现，细胞膜上Na+，K+-ATP酶活性明显减低。而目前关于Na+，K+-ATP酶在稳定转染TDP-25运动神经元样细胞中活性特征的研究较少。
　　目的:分别检测稳定表达转染TDP-25蛋白和空质粒的运动神经元样细胞的Na+，K+-ATP酶活性，并比较两种细胞间是否存在差别，以探究TDP-25细胞兴奋性水平的变化;验证Na+，K+-ATP酶是否存在两种不同的亚基及其在TDP-25细胞中的变化;分析TDP-25蛋白在ALS发病机制中的作用。
　　方法:本实验选用稳定转染Empty vector（空质粒）、TDP-25两种NSC34细胞系，空质粒细胞系作为正常对照。这两种细胞系由本实验室构建，采用脂质体将TDP-25基因转染到NSC34细胞。参考NSC34细胞系的方法对其进行培养，通过筛选、免疫组化技术鉴定等方法，将单克隆细胞系进行培养、传代。运用全细胞膜片钳技术，记录两种细胞在静息状态下和给予10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L浓度梯度哇巴因灌流液后Na+，K+-ATP酶活性被抑制后的膜电流，通过统计作图比较，检测其Na+，K+-ATP酶活性以及不同亚基的特性。
　　结果:转染TDP-25基因的细胞（TDP-25组）和转染空质粒的细胞（Empty组）酶电流的比较。将给予不同浓度哇巴因的灌流液前后所记录的膜电流经统计后结果如下，TDP-25组:10-9mol/L(n=6):0.10538±0.07058,10-8mol/L(n=6):0.10122±0.07452,10-7mol/L(n=6):0.23377±0.0683,10-6mol/L(n=6):0.48538±0.1471,10-5mol/L(n=6):0.47068±0.08315,10-4mol/L(n=6):0.64007±0.04886Empty组:10-9mol/L(n=9):0.10662±0.08123,10-8mol/L(n=6):0.15378±0.04578,10-7mol/L(n=7):0.32086±0.09789,10-6mol/L(n=6):0.28407±0.12265,10-5mol/L(n=7):0.60686±0.11757,10-4mol/L(n=8):0.69882±0.1077将TDP-25组和E组结果分别进行非线性指数拟合，得出双指数拟合图形及方程，拟合方程为:IP=fh×k[Oua]K-high/[Oua]+K-high+fl×k[Oua]K-low/[Oua]+K-low其中，IP代表Na+，K+-ATP酶电流，k代表当高亲和力或低亲和力结合位点与Oua结合时一个Na+，K+-ATP酶分子产生的电流，K-high代表高亲和力Na+，K+-ATP酶抑制性Oua结合位点的解离系数，K-low代表低亲和力Na+，K+-ATP酶抑制性Oua结合位点的解离系数，fh代表高亲和力Na+，K+-ATP酶占总Na+，K+-ATP酶电流的百分比，fl代表低亲和力Na+，K+-ATP酶占总Na+，K+-ATP酶电流的百分比，[Oua]代表Ouabain的浓度。
　　根据K-high和K-low的不同，将Na+，K+-ATP酶分为高亲和力和低亲和力两种。
　　拟合结果如下:
　　Empty组:高、低亲和力Na+，K+-ATP酶的Oua抑制性结合位点解离系数分别为58.79 nmol/L和197.67μmol/L，二者占总Na+，K+-ATP酶电流的百分比分别为21.8％和78.2％.
　　TDP25组:高、低亲和力Na+，K+-ATP酶的Oua抑制性结合位点解离系数分别为32.86 nmol/L和168.95μmol/L，二者占总Na+，K+-ATP酶电流的百分比分别为32.6％和67.4％.
　　结论:神经元中的Na+，K+-ATP酶中，与哇巴因结合的α亚基存在两种不同位点，TDP-25可以同时增强高亲和力和低亲和力结合位点对哇巴因的敏感性，同时上调高亲和力Na+，K+-ATP酶的表达。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述 Na+，K+-ATP酶与神经系统变性疾病

致谢

个人简历