马索罗酚和丹参酮ⅡA对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脾淋巴细胞的抗氧化应激和免疫调节作用

摘要

目的:多发性硬化(MultipleSclerosis，MS)，是累及中枢神经系统(CNS)的一种慢性炎症性脱髓鞘性疾病，发病机制尚不明确。大多数研究表明，免疫损伤和氧化应激在MS的发病机制中起重要作用。Nrf2/ARE通路的激活能够保护机体免受免疫及氧化应激的损伤，本课题组前期应用Nrf2通路的经典激活剂莱菔硫烷初步证实了激活此通路能够降低EAE发病率以及减轻疾病严重程度。而莱菔硫烷尚未用于临床，我们希望通过实验，从已经用于临床的Nrf2通路激活性药物中筛选出抗氧化、调节免疫等方面可以跟莱菔硫烷媲美的药物，从而为MS的治疗提出新的药物。马索罗酚是一种化疗药物，丹参酮ⅡA常用于冠心病的治疗，此两者都被证实具有Nrf2通路激活剂的作用，本实验利用实验性自身免疫性脑脊髓炎(ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)小鼠的脾细胞，研究马索罗酚和丹参酮ⅡA对EAE小鼠脾细胞中抗氧化酶、细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的表达的调节作用，初步探讨马索罗酚和丹参酮ⅡA对EAE的抗氧化和免疫调节作用，一方面希望为MS的治疗提出新的药物，另一方面希望能挖掘这两种药物在调节免疫方面的特性。
　　方法:选择8只C57BL/6雌性小鼠，周龄8-10周，体重18-22g，利用MOG35-55多肽、结核杆菌、完全弗氏佐剂、百日咳毒素等对小鼠进行免疫制作成EAE模型，每天2次对其进行神经功能的评分，于发病高峰(8分及以上，约免疫后20天)随机选择5只处死，在无菌的环境中取出脾脏，并用10％胎牛血清的RPMI1640无菌培液制备成单细胞悬液（细胞密度控制在5*106/L左右），并给予MOG35-55多肽进行再刺激。将此细胞悬液随机分为对照组、莱菔硫烷组、马索罗酚组和丹参酮ⅡA组，空白对照组加入无菌DMSO（0.6μl/200ul）莱菔硫烷组加入莱菔硫烷稀释液（0.9μg/ml）马索罗酚组加入马索罗酚稀释液（6.0μg/ml）丹参酮ⅡA组加入丹参酮ⅡA稀释液（3.0μg/ml），保证所有组的DMSO含量均≤0.3％。将4组细胞悬液培养24小时后离心，利用Westernblot的方法检测细胞沉渣中的Ⅰ型血红素氧化酶HO-1，采用ELISA的方法检测上清液中的IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的表达水平。
　　结果:
　　1、小鼠脾细胞中HO-1表达情况:莱菔硫烷组、马索罗酚组、丹参酮ⅡA组EAE小鼠脾细胞与对照组相比，HO-1的表达明显增多，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。丹参酮ⅡA组HO-1表达明显高于莱菔硫烷组及马索罗酚组(P＜0.05);莱菔硫烷组与马索罗酚组HO-1表达相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2、上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的表达情况:莱菔硫烷组、马索罗酚组、丹参酮ⅡA组与对照组相比，IFN-γ的表达无明显统计学差异(P＞0.05);IL-4、IL-10的表达明显增多，差异均具有统计学意义(P＜0.05);IL-17A的表达明显减少，差异均具有统计学意义(P＜0.05);莱菔硫烷组、马索罗酚组及丹参酮ⅡA组IL-4、IL-10、IL-17A的表达相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、马索罗酚、丹参酮ⅡA都能够上调EAE小鼠脾淋巴细胞中的IL-4、IL-10等抑炎因子的表达，下调促炎因子IL-17A的表达，具有调节免疫平衡的能力。
　　2、马索罗酚、丹参酮ⅡA能够上调EAE小鼠脾淋巴细胞中的HO-1的表达，具有抗氧化的能力。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 主要试剂和药品

2 主要仪器

3 主要溶液的配制

4 实验方法

5 数据分析

结果

1 通过Western blot的方法测定各组EAE小鼠脾细胞HO-1蛋白的表达情况

2 通过ELISA测定小鼠脾细胞培养液上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A的浓度

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 Nrf2／ARE通路的抗氧化应激与免疫调节作用与多发性硬化的发病机制

致谢

个人简历