Draxin在正常小鼠触须毛囊的表达及对毛发生长的作用

摘要

目的:触须是毛发的一种，其生长和脱落经历生长期、衰退期和静止期的周期性变化，称之为毛囊周期。毛囊是复杂微小器官，主要包括毛球、结缔组织根鞘、外根鞘、内根鞘、毛根和毛干。胚胎时期毛囊的形成，以及出生后毛囊形态结构的周期性变化，是真皮-表皮细胞相互作用的结果。真皮毛乳头细胞分泌多种活性蛋白和细胞因子，诱导表皮干细胞增殖、分化，导致毛囊周期各个阶段形态结构发生改变。Draxin是新近发现的轴突生长导向因子，在中枢神经系统的发育过程中，排斥联合神经元轴突从背侧到腹侧的投射。DCC是draxin的受体，在毛囊表皮干细胞高度表达，因此本实验探讨draxin是否在毛乳头部位表达并参与毛囊周期各阶段毛囊形态结构变化调控。本实验运用HE染色、免疫荧光和拔毛后触须生长长度检测等技术，观察正常小鼠触须毛囊周期各阶段毛囊结构的变化、draxin在毛囊内的分布情况以及不同类型小鼠拔毛后触须生长长度的不同，初步探讨draxin在正常小鼠触须毛囊内的表达及其对触须生长可能的调控作用。
　　方法:
　　1.实验动物和分组:选用健康雌性的7-8周龄清洁级野生型小鼠(draxin+/+)和draxin基因敲除型小鼠(draxin-/-)共42只(draxin基因敲除型小鼠由日本熊本大学田中英明教授友情馈赠)。把36只野生型小鼠随机分成6组，每组6只。其中五组分别为拔毛后5天组、10天组、16天组、20天组和25天组;剩下一组作为对照组和6只draxin-/-小鼠进行拔毛后若干时间点触须生长长度对比，所有动物均在符合清洁标准的实验室(T22-25℃，湿度50-70％)常规喂养。
　　2.毛囊周期同步化的建立:根据Paus等的方法选用7-8周龄雌性draxin+/+和draxin-/-小鼠。用松蜡合剂进行脱毛，一次未拔净者，重复此过程，直至触须完全拔净为止，脱毛当天为毛发周期第0天。
　　3.实验组织的获取:选取拔毛后5天、10天、16天、20天、25天野生型小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥钠（50mg/kg）麻醉，断颈处死。用小镊子夹起触须部皮肤，用剪刀剪开皮肤，取大小约1cm×1cm皮肤。迅速在0.1MPBS缓冲液中清洗，然后平铺在滤纸片上，将其放入4％的多聚甲醛中，冰上摇床摇晃固定3小时，然后放入30％蔗糖中，4℃过夜，第二天用小镊子固定皮肤，用手术刀片顺着触须排列的方向将皮肤切成小块，将其放入盛有O.C.T的四孔板中，放入时将修好的一面朝下放正，迅速放入-80℃冰箱，待其凝固后保存或使用。
　　4.冰冻切片的制备、HE及免疫荧光染色:取出的组织块，将其固定在冰冻切片机上，顺着毛囊的方向进行连续切片，片厚10um;然后将其贴于防脱粘附载玻片上，37℃恒温烤片机上烤片30分钟。HE染色观察野生型小鼠拔毛后5个时间点毛囊形态学上的改变;免疫荧光技术检测draxin在毛囊内的表达情况。
　　5.拔毛后触须生长长度检测:用奥林巴斯全能显微镜对野生型小鼠和draxin基因敲除型小鼠进行触须部位图像采集，测量触须生长长度。开始触须较短时，用显微镜上的标尺测量，长到一定长度后，用直尺测量。对比野生型小鼠与draxin基因敲除型小鼠拔毛后5天、10天、16天、20天、25天触须长度并进行统计学分析。
　　结果:
　　1.HE染色:拔毛后5天可见:毛乳头近似圆形，由膨大的毛球完全包绕。黑色素颗粒沉积在毛球和内根鞘基底部。新毛根较短，没有到达皮脂腺部位。旧毛根位于新毛根上方，没有完全脱落。拔毛后10天可见:新毛根向上生长到达皮脂腺部位或超越皮脂腺，部分毛囊仍可见没有完全脱落的旧毛根，但比拔毛后5天更接近皮肤。拔毛后16天可见:毛乳头和毛球变狭窄，黑色素颗粒减少，新毛根顶端到达皮肤表面。拔毛后20天可见:毛乳头被毛球部分包绕，毛囊长度缩短，毛根与毛球、内根鞘脱离，毛囊变短并向上回缩。拔毛后25天可见:毛乳头从毛球中彻底分离出来，位于毛球下方，毛囊继续向上回缩，接近皮脂腺部位。
　　2.免疫荧光:拔毛后5天，draxin在毛乳头内有较强表达;拔毛后10天，draxin在毛乳头内表达增强;拔毛后16天，draxin在毛乳头内表达开始减弱;拔毛后20天和25天，draxin在毛乳头内表达微弱。拔毛后5天，draxin在结缔组织根鞘内有强表达，但拔毛后10天，16天，20天和25天draxin在结缔组织根鞘内表达微弱。此外，毛球、外根鞘、内根鞘和毛根等处，在拔毛后各个时期内均未见draxin表达。
　　3.拔毛后触须生长长度检测:拔毛后5天、10天、16天、20天和25天野生型小鼠新生触须的长度，除拔毛后5天两型小鼠触须未长出外，均较draxin基因敲除型小鼠新生触须的长度短，差异有统计学意义。
　　结论:
　　1.拔毛后5天、10天、16天、20天和25天分别属于毛囊周期生长期早期、生长期中期、生长期晚期、衰退期和静止期五个阶段。
　　2.在毛囊周期上述五个阶段，draxin在毛乳头持续表达，呈现动态趋势，其中生长期中期表达最强，静止期表达最弱。
　　3.Draxin敲除型小鼠新生触须较同期野生型小鼠长，提示draxin可能对触须生长起到抑制作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 主要器械和试剂

2 主要溶液的配制

3 实验动物和方法

结果

1 HE染色

2 免疫荧光

3 拔毛后触须生长长度检测

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 毛发周期调控新进展

致谢

个人简历