线粒体DNA D-loop区单核苷酸多态性与上皮性卵巢癌患者预后的关联性研究

摘要

目的:线粒体基因（mitochondrial DNA，mtDNA）是唯一的核外遗传物质。而线粒体是真核生物中重要的细胞器，被称为细胞的“能量工厂”，这就决定了mtDNA处于氧自由基产生的场所，使其更易受到攻击，且与核基因相比，缺乏组蛋白的保护，因此mtDNA更易出现基因损伤畸变，进而累积导致细胞的肿瘤变。因此，mtDNA广泛存在于肿瘤及其相关疾病。
　　人类的mtDNA是一个长约16569bp的双链核苷酸封闭环，由两条不对称的核苷酸链组成，即重链（H链）和轻链（L链）。mtDNA共包含了37个结构编码基因，编码了13个氧化磷酸化相关多肽和22个tRNA，其中28个位于重链，其余位于轻链。mtDNA的非编码区主要位于D环(displaceloop，D-loop)，由三个高变区(Hypervariable region，HVRⅠ，HVRⅡ，HVRⅢ)组成，是mtDNA复制的起始点所在，包含了两条链的转录启动子和重链的复制起始点，因此D-loop又称之为mtDNA的控制区，在mtDNA复制和转录中起着重要的作用。目前，研究表明该区域基因突变与多种实体肿瘤发病风险相关，如头颈部肿瘤，肝癌，食管癌等。但是关于此片段基因位点多态性与上皮性卵巢癌的发病率与预后相关性研究很少，因此，本课题以此为切入点通过测定卵巢癌组织中线粒体DNA D-loop区基因序列，分析该片段单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）与上皮性卵巢癌预后的关联性，并分析患者临床特征和预后的关系以期为上皮性卵巢癌的个体化治疗及预后评估提供实验依据，。
　　方法:
　　1研究对象及随访选取2005年1月-2009年12月期间在河北医科大学第二医院妇科行手术治疗，术后病理证实为上皮性卵巢癌且术前均未接受任何相关激素治疗及新辅助化疗的患者，详细记录患者相关临床资料，通过门诊复查、电话、信件随访患者上皮性卵巢癌术后的生存情况，随访截止时间为2012年12月。
　　2 mtDNA的提取、扩增及测序:利用QIGEN提取石蜡组织中DNA试剂盒提取标本DNA组，鉴定合格后，设计上下游引物，进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳证实后进行测序，同一标本采用双向重复测序。
　　3统计学分析:采用IBM SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析，P＜0.05有统计学意义。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-Rank法比较单因素生存期的差异，用COX风险回归模型对多个预后影响因素进行分析。
　　结果:
　　1对89例上皮性卵巢癌患者的mtDNA D-loop区单核苷酸多态位点进行单因素生存分析，结果显示位于309 C/T，324 C/G，446 C/A SNPs与患者预后相关。309位点C基因型与T基因型的3年生存率分别为69.88％、33.33％，C基因型的患者预后优于T基因型(P=0.021);324位点C基因型与G基因型的3年生存率分别为69.88％、33.33％，C基因型的患者预后优于G基因型（P=0.004）;446位点C基因型与A基因型的3年生存率分别为69.05％、40％，C基因型的患者预后优于A基因型(P=0.044)。
　　2对89名上皮性卵巢癌患者的临床特征与预后进行单因素分析，结果显示病理类型（浆液性腺癌、粘液性腺癌、子宫内膜样腺癌、其他，P=0.559）、术后是否接受化疗（是、否，P=0.097）与患者术后生存时间的关联无统计学意义，年龄（≦55岁、＞55岁，P=0.035）、FIGO分期(Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ，P=0.013)、残余病灶大小（＞1cm、＜1cm，P=0.049）均与患者预后有明显关联性。
　　3将单因素分析中有统计学意义的预后影响因子纳入COX模型多因素分析中，结果示FIGO分期、309 C/T、324 C/G是影响上皮性卵巢癌预后的独立因素(P＜0.05)，95％可信区间依次为1.050-8.577、1.369-12.058、1.849-17.181，Ⅲ-Ⅳ期患者的死亡风险是Ⅰ-Ⅱ患者的2.929倍;309位点T基因型患者的死亡风险是C基因型患者的4.063倍;324位点G基因型患者的死亡风险是C基因型患者的5.636倍。
　　4对89例上皮性卵巢癌患者的mtDNA D-loop区SNPs与患者发病年龄进行分析，结果显示248 A/G，524 C/del和16304T/C单核苷酸多态位点与患者发病年龄相关。248位点G基因型患者发病年龄早于常见基因型A基因型患者;524位点del基因型患者发病年龄晚于常见基因型（C基因型）患者，16304位点C基因型患者发病年龄早于T基因型患者。
　　结论:
　　1 mtDNA中D-loop区位于309，324，446位点的SNPs与患者预后相关，其中309 C/T，324 C/G的可作为影响上皮性卵巢癌患者预后的独立因素，两者均是C基因型患者的预后较好。D-loop区基因多态性有望成为评估上皮性卵巢癌患者预后的新指标，指导临床治疗和个体预后评估。
　　2上皮性卵巢癌患者的年龄、临床FIGO分期、残余病灶大小均与患者预后有明显关联性。其中临床FIGO分期可作为影响上皮性卵巢癌患者预后的独立因素，Ⅰ-Ⅱ患者的预后明显优于Ⅲ-Ⅳ期患者。
　　3此外，根据mtDNA中D-loop区单核苷酸多态性可分为不同基因亚型可能与上皮性卵巢癌的发病年龄大小有关:248 A/G，524 C/del和16304T/C单核苷酸多态位点与患者发病年龄相关。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 研究对象

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 上皮性卵巢癌mtDNA D-loop区的单核苷酸多态性改变

2 上皮性卵巢癌的单因素生存分析

3 上皮性卵巢癌预后的COX模型多因素分析

4 上皮性卵巢癌的mtDNA D-loop区的单核苷酸多态性与其发病年龄

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 线粒体基因畸变与实体肿瘤的研究进展

致谢

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