TNFR在下咽鳞状细胞癌中的表达及利用基因开关调控TNFR表达对下咽癌化疗、TNF治疗的增敏作用

摘要

下咽癌(hypopharyngeal carcinoma)恶性度较高，邻近扩散、淋巴结转移都较早。下咽癌的病理分型以下咽鳞状细胞癌（hypopharyngealsquamous cell carcinoma，HPSCC）最多见。因为发病部位隐蔽，下咽癌很难早期发现，且易沿粘膜下扩散，临床发现的时候很多已经达到中晚期，能够接受手术的病例非常有限，大约只在60％左右，五年生存率大约为20％-40％。尽管现代医学飞速发展，诊疗设备、外科手术和放化疗等综合诊疗手段在不断改进，但在最近的二十余年里HPSCC的五年生存率并没有明显的改善和提高。开发和应用更加有效的肿瘤治疗手段，寻求更加有效的治疗策略对提高HPSCC的治疗水平至关重要。
　　已经证实在肿瘤发生、发展过程中，分子生物学机制发挥着至关重要的作用，因而越来越多的学者关注于基因治疗，试图从肿瘤的发生根源寻找遏制肿瘤的方法。人们理想的基因治疗是可以根据疾病的严重程度来调节治疗基因在特定器官内的表达水平。但是在基因治疗领域如何对特定基因定时、定量地调控并研究其不同表达水平下的作用是一个难题。依赖于热休克蛋白、激素或重金属等的传统基因表达诱导系统，存在着高本底、多嗜效应和环境污染等缺陷，限制了其应用和发展。Gossen等创建的基因开关系统，又称为四环素诱导表达开关系统（Tet-on/off系统）克服了传统诱导系统的不足。这种系统是通过原核大肠杆菌Tnol转座子调控元件，在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系。该系统被认为是目前最理想的真核生物基因表达系统，具有高效、特异、严密等特点，在基因功能和治疗等领域已被国内、外学者广泛地应用。但是，尚未有HPSCC方面的相关研究报道。
　　TNF-α(tumor necrosis factor-α，以下简称TNF)于30年前被发现，是到目前为止发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，对多种肿瘤细胞具有选择性的细胞毒作用。TNF既能直接杀死肿瘤细胞，又能通过激活免疫系统发挥抗肿瘤作用。它的最显著的活性特征是可以在体内外特异的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显的毒性作用。但是，由于TNF在体内的半衰期较短，低剂量的应用抗肿瘤效果不太显著，甚至在某些肿瘤，还有促进肿瘤细胞增殖的作用，要达到疗效水平，需持续大剂量注射，这通常会引起发热、寒战、疲劳、头痛、休克等全身症状，临床应用的效果不太理想，大大限制了TNF的使用范围。
　　TNF主要通过与两个受体:TNF受体1（tumor necrosis factor receptor1，TNFR1）和TNF受体2(tumor necrosis factor receptor2，TNFR2)结合来发挥生物学作用。这两类受体均由信号肽、胞浆结构区、跨膜结构区和胞外结构区组成。两类受体的胞外区同源性为28％，胞内区没有同源性，提示两类受体介导的是不同的信号传递通路。TNFR1可产生两种相反的作用效应，它既可诱导产生TNF的毒性效应，促进细胞凋亡、坏死，又可以通过激活NF-κB促进增殖。TNFR2也具有两种作用途径，它既可以增强TNFR1引起的凋亡，又可独立诱导凋亡，还可以促进增殖。两种受体在什么情况下选择哪种通路，仍不完全清楚。有研究表明在细胞表面TNFR的表达水平变化可以改变细胞对TNF的敏感性，细胞表面的TNFR数目越高，对TNF的细胞毒性作用就越敏感，而对TNF作用不敏感的肿瘤细胞，细胞表面的TNF受体缺如或几乎观察不到，受体数目与肿瘤细胞敏感性呈正相关。可见，TNFR对机体的TNF作用具有重要的调节作用。
　　TNF与多种化疗药物具有协同作用。经研究表明TNF与化疗药物联合应用可明显增强软组织肉瘤、黑色素瘤、胃癌、肺癌等多种肿瘤的化疗效果。但是尚未有相关的研究在头颈部肿瘤中开展。并且，TNF与化疗药物协同作用的机理及调控机制未完全清楚。不管其确切的机制如何，在下咽癌的治疗过程中，如何提高肿瘤的杀伤作用并同时减少TNF和化疗药物的用量，是肿瘤治疗的核心问题。肿瘤细胞的TNFR表达水平对这一协同作用可能具有重要影响，与其相关的研究可能具有重要意义。
　　本研究用免疫组化和Western blot的方法检测TNFR1和TNFR2在HPSCC组织中的表达，分析TNFR表达与HPSCC临床病理因素的关系。通过慢病毒构建利用基因开关系统稳定高表达人TNFR2基因的下咽癌FaDu细胞系。研究TNF、顺铂（cisplatin，DDP）及二者联合作用对TNFR正常表达的下咽癌FaDu细胞增殖、凋亡的影响。观察当用中和抗体阻断TNFR1的作用、利用基因开关系统高表达TNFR2后、以及同时阻断TNFR1作用、高表达TNFR2后，TNF、DDP作用后，细胞系增殖、凋亡情况的变化，分析TNFR表达变化与TNF、DDP敏感性的关系，探讨下咽癌的TNF、DDP治疗抵抗与TNFR表达水平之间的关系，为临床减少化疗药物的用量，提高下咽癌的治疗水平提供理论基础和依据。研究分为三部分:
　　第一部分 TNFR在下咽鳞状细胞癌中的表达及与临床病理因素的关系目的:检测TNFR1和TNFR2在HPSCC组织中的表达，并且与临床诸病理因素进行相关分析，探讨TNFR的表达与HPSCC发生、发展的关系。
　　方法:
　　1用免疫组织化学SP染色的方法检测45例HPSCC组织及配对癌旁下咽粘膜组织中TNFR1和TNFR2的表达，并与临床病理因素进行分析。
　　2 Western blot检测3例HPSCC患者癌组织和癌旁下咽粘膜组织中TNFR1及TNFR2的表达。
　　结果:
　　1免疫组织化学染色结果1.1 TNFR在HPSCC组织及癌旁组织中的表达:45例HPSCC癌组织中，TNFR1和TNFR2的阳性表达率均为100％。TNFR1在癌旁粘膜组织中的表达率为50％，TNFR2在癌旁下咽粘膜组织中的表达率为10％。与癌旁下咽粘膜组织比较，TNFR1与TNFR2在HPSCC癌组织中的阳性表达率均明显升高(P＜0.01)，表达水平也显著高于癌旁下咽粘膜组织(P＜0.01)1.2 TNFR与HPSCC临床病理因素的关系:
　　在45例HPSCC病人中，TNFR1和TNFR2的AOD在60岁以下组和60岁以上组的差异经统计学分析无明显差异（TNFR1:t=0.125，P=0.901; TNFR2:t=0.149，P=0.883）。在37例男性病人和8例女性病人中，TNFR1和TNFR2的表达与性别无差异（TNFR1: t=0.060，P=0.952;TNFR2:t=0.959，P=0.343）。45例HPSCC中，30例为梨状窝型，10例环后区型，5例为下咽后壁区，TNFR1和TNFR2的表达在三种分型中的表达无统计学差异（TNFR1:F=0.169，P=0.845;TNFR2:F=1.888，P=0.164)。
　　TNFR1在13例高分化鳞癌中的AOD为0.192±0.051，在32例低分化鳞癌中的表达为0.239±0.029，两者之间有显著差异(t=3.822，P＜0.01);TNFR1在T3-T4表达的AOD为0.239±0.030，明显高于其在T1-T2期的表达(AOD为0.178±0.044)两者之间有显著性差异(t=5.087，P＜0.01);TNFR1在临床分期Ⅲ-Ⅳ级的AOD为0.241±0.029，表达高于Ⅱ期的AOD为0.187±0.045，两者之间有显著统计学差异（t=4.751，P＜0.01）;TNFR1在淋巴结转移的病例中的表达0.241±0.030明显高于无淋巴结转移组0.194±0.046，差异具有统计学意义(t=4.189，P＜0.01)。TNFR1在HPSCC癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、肿瘤的T分期、临床分期、淋巴结转移密切相关，而与性别、年龄、分型无关(P＞0.05)。
　　TNFR2在高分化鳞癌13例中AOD为0.226±0.055，在32例低分化鳞癌中的表达为0.205±0.040，在10例T1-2分期组织中表达的AOD为0.227±0.061，在T3-4期AOD为0.206±0.040，在临床分期为Ⅱ期的AOD为0.221±0.057，Ⅲ-Ⅳ0.207±0.040，在30例淋巴结转移的组织中表达的AOD为0.202±0.036，在15例无淋巴结转移的AOD为0.229±0.056。经统计学分析，TNFR2的表达与HPSCC患者的年龄、性别、肿瘤的生长部位、分化等级、临床分期、T分期均无相关性（P均＞0.05）。
　　2 TNFR1与TNFR2的相关性分析TNFR1和TNFR2的表达经统计学分析呈负相关(rs=-0.305)，TNFR1与TNFR2的AOD比值与HPSCC的分化程度、T分期、临床分期、淋巴结转移密切相关，而与性别、年龄、分型无关（P均＞0.05）。TNFR1与TNFR2在HPSCC的发生、发展中存在一定的相互调节作用，其确切机制有待我们进一步研究。
　　3 Western blot结果:
　　TNFR1在3例HPSCC癌组织中的表达为0.822±0.144，在3例癌旁下咽粘膜组织表达为0.080±0.104，TNFR1在癌组织中的表达明显高于在癌旁下咽粘膜组织的表达，两者之间有统计学差异(t=5.079，P＜0.05)。TNFR2在3例HPSCC癌组织中的表达为0.775±0.072，在3例癌旁粘膜组织中的表达为0.010±0.005，TNFR2在HPSCC癌组织中的表达显著高于癌旁粘膜组织中的表达，经统计学分析，两者之间有显著差异(t=17.333, P＜0.01)。
　　结论:TNFR1和TNFR2在HPSCC癌组织中的表达较癌旁下咽粘膜组织均明显升高。TNFR1的表达水平与肿瘤的病理分化程度、肿瘤T分期、临床分期和淋巴结转移密切相关;TNFR2的表达与肿瘤的临床病理因素无显著关系;TNFR1与TNFR2的表达呈负相关，两者的比值与HPSCC的临床病理因素呈正相关，说明TNFR1和TNFR2之间存在着一定的负调节关系。TNFR在HPSCC的发生、发展中发挥着重要的作用。
　　第二部分慢病毒介导的利用基因开关稳定高表达人TNFR2基因的下咽癌FaDu细胞系的建立目的:构建慢病毒介导的利用基因开关系统稳定高表达人TNFR2基因的下咽癌FaDu细胞系，为后续研究调控TNFR表达对TNF、DDP作用的影响提供细胞模型。
　　方法:
　　1 Tet-on-Puro-TNFR2慢病毒载体的构建TNFR2基因序列调取引物由上海桑尼生物合成，TNFR2原始ORF（open reading frame，ORF）购自汉恒生物科技（上海）有限公司，PCR扩增TNFR2ORF序列，并将PCR产物与Tet-on系列慢病毒载体pHBTet-on-Puro同步XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收。将酶切的PCR产物与载体连接过夜后转化感受态细胞，转化后的TNFR2平板挑菌，菌液进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送上海桑尼生物技术有限公司测序。
　　2构建质粒的包装前准备2.1慢病毒系统构成:三质粒Tet-on慢病毒系统包括慢病毒质粒pHBTet-on-Puro-TNFR2（对照为pHBTet-on-Puro空质粒，该Tet-on慢病毒系统购自上海汉恒生物科技有限公司），包装辅助质粒:pspax2、pMD2G，其中pHBTet-on-Puro-TNFR2具有Puromycin药物抗性，可以进行药物筛选;同时带有药物诱导下启动子UBC，可以通过强力霉素(Doxorubicin，Dox)诱导目的基因TNFR2的表达。
　　2.2慢病毒载体高纯度制备:将制备的慢病毒质粒pHBTet-on-Puro-TNFR2（对照为pHBTet-on-Puro空质粒）及其辅助包装原件载体质粒pspax2、pMD2G，分别进行高纯度无内毒素抽提，制备出高纯度的慢病毒质粒及包装辅助质粒。
　　3慢病毒包装
　　用LipoFiterTM脂质体介导慢病毒载体pHBTet-on-Puro-TNFR2（对照为pHBTet-on-Puro空质粒）与pspax2，pMD2G共转染293T细胞，进行慢病毒包装。72小时后收取病毒上清并进行超速离心浓缩，用500ulDMEM重悬慢病毒颗粒。
　　4稳定可调控表达TNFR2基因FaDu细胞系的构建将浓缩的慢病毒颗粒感染人下咽癌FaDu细胞，嘌呤霉素筛选一周，得到稳定可调控表达TNFR2基因的下咽癌FaDu细胞。进一步扩增细胞并进行传代，保种，扩增及下一步检测实验。
　　5 Tet-on调控TNFR2基因的稳定转染FaDu细胞系的验证扩增后一部分细胞用于保种，一部分细胞加入2ug/ml的Doxorudicin诱导24小时之后，收集细胞蛋白，实时定量PCR和Western Blot检测转染前后FaDu细胞中TNFR2的mRNA及蛋白的表达。
　　结果:
　　1将质粒转化感受态细胞，挑取阳性克隆扩增后提取质粒，经测序分析，结果与实验设计一致。
　　2用最优筛选浓度为2.0μg/ml的嘌呤霉素筛选出稳定表达Tet-on系统的FaDu细胞克隆。
　　3经实时定量PCR检测稳定表达Tet-on-Puro-TNFR2下咽癌FaDu细胞与对照组在加入Dox诱导24小时后比较，TNFR2的mRNA水平明显增高，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　4 Western blot法检测稳定表达Tet-on-Puro-TNFR2下咽癌FaDu细胞与对照组在加入Dox诱导24小时后比较，TNFR2的蛋白水平明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　结论:利用慢病毒载体成功构建利用Tet-on系统稳定高表达人TNFR2基因的下咽癌FaDu细胞系，为后续研究该基因的功能提供细胞模型。
　　第三部分利用基因开关调控TNFR表达对下咽癌化疗、TNF治疗的增敏作用目的:观察在TNFR1和TNFR2正常表达的Fadu细胞，TNF和DDP对细胞增殖、凋亡的影响;在TNFR1正常作用，TNFR2高表达的Fadu细胞，TNF和顺铂对细胞增殖、凋亡的影响变化;以及在TNFR1作用被阻断后，TNF和DDP对细胞增殖、凋亡的影响变化;最后观察阻断TNFR1作用联合TNFR2高表达情况下，TNF和DDP对Fadu细胞增殖、凋亡的影响变化，分析TNFR1和TNFR2表达的变化对TNF和DDP作用敏感性的影响。
　　方法:
　　本部分主要研究人为调控TNFR1和TNFR2表达变化时，TNF、DDP以及二者联合作用情况下，Fadu细胞增殖、凋亡情况的变化。利用MTT法检测Fadu细胞的增殖抑制作用;流式细胞Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况。
　　1研究TNF、DDP以及两者联合作用对TNFR正常作用的Fadu细胞增殖、凋亡的影响。
　　2研究利用中和抗体阻断TNFR1作用后，TNF、DDP以及两者联合作用对Fadu细胞增殖、凋亡情况的影响变化。
　　3研究在TNFR1正常作用，TNFR2高表达后，TNF、DDP以及两者联合作用对Fadu细胞系增殖、凋亡情况的影响变化。
　　4研究高表达TNFR2联合阻断TNFR1作用后，TNF、DDP以及两者联合作用对Fadu细胞系增殖、凋亡情况的影响变化。
　　结果:
　　1 MTT检测结果1.1稳定表达Tet-on-Puro的Fadu细胞系（A组），TNF在低浓度(0.1，1，10 ng/ml)时对Fadu细胞有促增殖作用，而高浓度（50-100 ng/ml）具有抑制肿瘤生长的作用。Fadu细胞系对DDP作用抵抗，6μg/ml的DDP作用24h后，肿瘤细胞存活率为81.8％。TNF在低浓度与DDP联合应用即可明显增强DDP的抗肿瘤效果。
　　1.2稳定表达Tet-on-Puro的Fadu细胞系，利用中和抗体阻断TNFR1作用后（B组），可逆转小剂量TNF(0.1-10 ng/ml)的促增殖作用(t=4.390，t=5.886，t=5.258，P均＜0.05)，并且低浓度与DDP联合作用对肿瘤的抑制作用较A组增强，高剂量（50-100 ng/ml）TNF单独或联合DDP应用，均与A组无显著差异（P均＞0.05）。
　　1.3稳定表达Tet-on-Puro-TNFR2的Fadu细胞系，Dox诱导TNFR2高表达（C组）后与A组相比，小剂量（0.1，1，10ng/ml）即对细胞具有增殖抑制作用，具有显著差异（P均＜0.01），高浓度（50-100 ng/ml）的TNF作用无差异（P均＞0.05）。Dox诱导后，可提高各浓度TNF与DDP联合应用的抗肿瘤效果，与A组相比，有统计学差异（P均＜0.05）。
　　1.4稳定表达Tet-on-Puro-TNFR2的Fadu细胞系，同时高表达TNFR2和中和TNFR1作用（D组），与A组相比，TNF各浓度对Fadu细胞均有明显的增殖抑制作用（P均＜0.05）;与B、C组相比，除TNF浓度为0.1ng/ml无差异，其他浓度均有更明显的增殖抑制作用，差异有统计学意义(P均＜0.05);TNF和DDP联合作用于D组细胞后，与A、B组相比，各浓度对Fadu细胞的增殖抑制作用均明显加强（P均＜0.05）;与C组相比，在TNF低浓度（0.1，1，10ng/ml）时联合DDP具有明显抑制作用，高浓度（50-100 ng/ml）无显著差异。
　　2流式细胞术Annexin V/PI双染色法检测TNF、TNF联合DDP对各实验组FaDu细胞凋亡率的影响2.1在10ng/ml的TNF作用下，B组与A组的凋亡率无显著差异(t=0.918，P=0.456)，C组比A组凋亡率明显增高(t=13.504，P＜0.01)。D组与A、B组相比凋亡率明显升高，具有统计学差异(t=12.424，t=10.058，P＜0.05);与C组相比，凋亡率无明显变化（t=0.624，P＞0.05）
　　2.210ng/ml的TNF和6μg/ml的DDP共同作用后，B组与A组凋亡率无显著差异;C组比A组凋亡率明显增高(t=8.498，P＜0.05);D组与A组、B组相比，凋亡率明显升高(t=4.606，t=4.737，P＜0.05);与C组相比，凋亡率无明显变化(t=0.795，P＞0.05)结论:
　　1在TNFR正常表达的下咽癌Fadu细胞系，TNF在低浓度（0.1-10ng/ml）时对Fadu细胞有促增殖作用，而高浓度（50-100ng/ml）具有抑制肿瘤生长的作用。TNF在低浓度与DDP联合应用即可明显增强DDP的抗肿瘤效果。
　　2在下咽癌Fadu细胞系中和TNFR1作用后，可逆转低浓度TNF的促肿瘤增殖作用，并且可增强低浓度TNF与DDP联合应用的抗肿瘤效果。
　　3在下咽癌Fadu细胞系中，TNFR2的表达增高可增强低浓度TNF和各浓度TNF联合DDP对肿瘤的增殖抑制作用，并可促进肿瘤细胞凋亡。
　　4在下咽癌Fadu细胞系中，同时中和TNFR1作用和高表达TNFR2，可显著促进TNF和DDP对肿瘤细胞的增殖抑制作用，并促进肿瘤细胞凋亡。
　　5 nFR1在下咽癌中很可能介导增殖通路，TNFR2可能介导凋亡通路，两者的作用途径有待我们进一步证实。同时调控TNFR1和TNFR2的表达有望明显提高下咽癌的TNF和DDP的治疗效果，克服治疗抵抗。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 TNFR在下咽鳞状细胞癌中的表达及与临床病理因素的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 慢病毒介导的利用基因开关系统稳定高表达人TNFR2基因的下咽癌FaDu细胞系的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 利用基因开关调控TNFR表达对下咽癌化疗、TNF治疗的增敏作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 TNF及TNFR的研究进展

致谢

个人简历