IL-17对小鼠结肠癌肿瘤组织中细胞因子表达及CD4+T细胞亚群分布的影响

摘要

目的:结肠癌是临床上常见的消化道肿瘤之一，好发于50～60岁人群，占所有癌症的第三位。[1，2]随着经济的高速发展，人们的生活水平不断提高，由此带来的饮食结构改变，如少纤维多脂肪，使得该病的发病率在全球范围内呈现逐年升高趋势。[3]目前对于结肠癌的治疗仍以手术作为首选方式，术后或术前结合化学治疗等辅助方法取得一定效果，但是其5年生存率低耐药性强等诸多因素，[4]促使我们亟待寻求更为有效的治疗手段。上个世纪80年代，肿瘤的生物治疗问世，至今已经成为第四种肿瘤治疗方法，而其中的免疫治疗为最常用的方法之一。[5]免疫疗法就是通过增强人体免疫力，调整机体抗瘤能力，达到抑制肿瘤的发生、发展及转移。细胞因子是一类具有多种生物学效应的小分子蛋白，其家族成员很多在肿瘤的发生、发展中起到重要作用，[6]因此细胞因子治疗已成为肿瘤免疫治疗的常用手段之一。IL-17作为Th17细胞的特征性细胞因子，其在肿瘤中的作用引起了我们的兴趣，前期研究结果显示接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠移植瘤体积明显小于接种C26细胞和C26/pcDNA3.1细胞的小鼠移植瘤大小，这说明IL-17可以抑制肿瘤的生长，但是IL-17并不影响各组小鼠的生存期。因此，本研究将对IL-17在结肠癌发生发展中的作用进行深入研究，并探讨其抗瘤机制。
　　方法:
　　1、荷瘤小鼠脾细胞亚群分布检测
　　荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后35天，取各组小鼠脾脏，利用密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，分别提取各组脾淋巴细胞的RNA，Real-Time PCR法检测与各Th细胞相关的特征性细胞因子和转录因子的表达。
　　2、IL-17对肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况检测
　　荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后35天，取各组小鼠肿瘤组织，甲醛固定后制备蜡块，切片后HE染色法观察接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织与接种C26/pcDNA3.1细胞和接种C26细胞的小鼠肿瘤组织中淋巴细胞浸润数量的区别。
　　3、IL-17对肿瘤组织中血管密度影响情况检测
　　荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后35天，取各组小鼠肿瘤组织，甲醛固定后制备蜡块，切片后免疫组化法标记血管，对比三组荷瘤小鼠肿瘤组织中血管数量。
　　4、荷瘤小鼠肿瘤组织中相关细胞因子检测
　　荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后35天，Real-Time PCR法和Western blot法检测肿瘤组织中相关细胞因子的表达情况。
　　5、荷瘤小鼠肿瘤组织中Th1，Th2，Th17，Treg细胞特征性转录因子的表达情况检测
　　荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后35天，分别取各组小鼠肿瘤组织，Real-TimePCR法分别检测Th1、Th2、Th17、Treg细胞的特征性转录因子。
　　6、IL-17对肿瘤细胞凋亡情况研究
　　荷瘤小鼠接种肿瘤细胞后35天，取各组小鼠肿瘤组织，甲醛固定制备蜡块，切片后TUNEL法检测各肿瘤组织中凋亡细胞数量。
　　结果:
　　1、IL-17影响荷瘤小鼠脾细胞亚群分布研究
　　Real-Time PCR法检测结果显示，与接种C26、C26/pcDNA3.1的荷瘤小鼠相比，IL-17可以使接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的荷瘤小鼠脾淋巴细胞中ROR-γt+细胞、IFN-γ+细胞、Th2+细胞和IL-10+细胞细胞增多（P＜0.05），同时IL-17+细胞、T-bet+细胞和Foxp-3+细胞的数量减少(P＜0.05);接种C26、C26/pcDNA3.1的荷瘤小鼠相比，脾细胞中各细胞因子或转录因子mRNA的水平无统计学差异(P＞0.05)。
　　2、IL-17对肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况研究
　　HE染色结果显示IL-17可以使小鼠肿瘤组织中淋巴细胞浸润数量明显多于接种C26/pcDNA3.1细胞和C26细胞的小鼠肿瘤组织(P＜0.05);接种C26、C26/pcDNA3.1的小鼠肿瘤组织淋巴细胞浸润数量无统计学差异（P＞0.05）。
　　3、IL-17对肿瘤组织中血管密度检测
　　免疫组化结果显示IL-17可以使小鼠肿瘤组织中CD34+和Nestin+血管数量多于接种C26/pcDNA3.1细胞和C26细胞的小鼠肿瘤组织(P＜0.05);接种C26、C26/pcDNA3.1的小鼠肿瘤组织血管数量无统计学差异(P＞0.05)。
　　4、荷瘤小鼠肿瘤组织中相关细胞因子检测
　　Real-Time PCR结果显示接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织比接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织高表达IL-17、IFN-γ、TGF-β和IL-23 mRNA（P＜0.05）;同时IL-17可以使接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织比接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织低表达IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13 mRNA（P＜0.05）;接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织各细胞因子表达情况无统计学差异（P＞0.05）。
　　Western blot法结果显示接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织比接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织高表达IL-17、IFN-γ蛋白;但是低表达IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13蛋白;接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织各细胞因子表达情况无明显差异。
　　5、荷瘤小鼠肿瘤组织中Th1，Th2，Th17，Treg细胞特征性转录因子的表达情况检测
　　Real-Time PCR结果显示接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织比接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织高表达ROR-γt(Th17特征性转录因子)和T-bet（Th1特征性转录因子）;但是低表达GATA-3（Th2特征性转录因子）和Foxp-3（Treg特征性转录因子）（P＜0.05）;接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织各转录因子表达无统计学差异(P＞0.05)。
　　Western blot法结果显示接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织比接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织高表达ROR-γt和T-bet蛋白，同时低表达Foxp-3蛋白;接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织该转录因子表达情况无明显差异。
　　6、IL-17对肿瘤细胞凋亡情况研究
　　TUNEL结果显示IL-17可以使接种C26/pcDNA3.1-IL-17细胞的小鼠肿瘤组织中凋亡细胞数量明显多于接种C26/pcDNA3.1细胞和C26细胞的小鼠肿瘤组织(P＜0.05);接种C26、C26/pcDNA3.1细胞的小鼠肿瘤组织凋亡细胞数量无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、IL-17基因转染可改变小鼠脾淋巴细胞不同亚群的分布。
　　2、IL-17基因转染可使肿瘤组织中淋巴细胞浸润数量增多。
　　3、IL-17基因转染可使肿瘤组织高表达IFN-γ，但低表达IL-10和IL-13因子，从而发挥抗肿瘤作用。
　　4、IL-17基因转染可使肿瘤组织中血管密度增加。
　　5、IL-17基因转染可使肿瘤组织中凋亡细胞数量增加。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 IL-17基因转染对荷瘤小鼠脾细胞各亚群分布的影响

2 IL-17基因转染对肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况影响

3 IL-17基因转染对小鼠肿瘤组织中细胞因子表达情况研究

4 荷瘤小鼠肿瘤组织中Th1，Th2，Th17，Treg细胞特征性转录因子的表达情况

5 IL-17基因转染对肿瘤细胞凋亡情况研究

6 IL-17对肿瘤组织中血管密度影响情况研究

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 IL-17对肿瘤微环境的影响

致谢

个人简历