Lipin-1在酒精性肝病发病机理中作用的实验研究

摘要

目的:酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于长期大量饮酒导致肝细胞中毒性损伤，肝脏病理改变最初表现为肝细胞脂肪变性、肝炎、肝纤维化，最终导致肝硬化。酒精性脂肪肝(alcohol fatty liver disease，AFLD)是ALD的早期表现，其发病机理主要为脂质代谢紊乱导致大量沉积于肝细胞，从而引起肝细胞脂肪变性、炎细胞侵润及纤维化等一系列病变[2]。近几年研究结果显示lipin-1在脂质代谢过程中具有促进甘油三酯合成和脂肪酸氧化双向调节作用。在细胞质中，lipin-1作为Mg2+依赖性的磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid hosphohydrolase，PAP)酶促进甘油三酯的合成;在细胞核中，lipin-1作为转录共刺激因子，一方面调节脂肪酸氧化;另一方面调控脂质合成酶活性。在AFLD的肝细胞中，酒精通过AMPKSREBP-1-lipin-1信号通路上调lipin-1的总量表达，通过SIRT1-SFRS10-Lpin1β/α轴上调Lpin1β/α的比例，lipin-1的高乙酰化/低类泛素化其胞浆转位，使细胞质中的lipin-1β增多，细胞核中的lipin-1α减少。此外，酒精还可以直接促进细胞质中lipin-1β的PAP活性，抑制lipin-1α在细胞核中的作用。综上，TG合成增多促进了脂质在肝细胞中聚集促进了AFLD疾病的进展。本研究通过酒精灌胃建立大鼠ALD模型，用病理学方法观察组织基本病变情况，通过分子生物学方法探讨lipin-1在酒精性肝病发病不同时间段的表达情况表达变化，为ALD防治提供一条新的思路。
　　方法:选用雄性Wister大鼠50只，体重200±20g，正常饲养7天，随机分出10只为正常对照组，其余40只用酒精灌胃，采用逐渐增加酒精浓度(浓度30％-60％，乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法，分别于第4周末随机处死10只大鼠、8周末9只、12周末8只、16周末8只;处死后立即取出肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱。分别应用实时荧光定量聚合酶连反应(RealTime-quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)和Western blot法检测剪切因子SFRS10和lipin-1（核、浆）的mRNA和蛋白表达水平。多组间均数比较采用单因素方差分析。
　　结果:
　　1、RT-qPCR法检测SFRS10、总lipin-1、lipin-1α及lipin-1β mRNA的表达。
　　1.1如Fig.1及Table2所示，正常组大鼠肝组织中表达SFRS10较多，随着造模时间的延长，其表达成逐渐减少趋势，正常对照组与实验组，16周组与其它各组比较（0.64±0.04 VS0.54±0.03，0.42±0.05，0.35±0.03，0.20±0.05;0.20±0.05 VS0.64±0.04,0.54±0.03,0.42±0.05,0.35±0.03），差异均有统计学意义(F值为129.05，P＜0.01)。
　　1.2如Fig.2及Table2所示，正常组大鼠组织中总的lipin-1、细胞质lipin-1β及细胞核lipin-1α表达均较少，随着造模时间的延长，总的lipin-1和lipin-1β表达量均逐渐增多，lipin-1α表达逐渐减少。正常对照组与实验组，16周组与其它各组比较（总lipin-1:0.20±0.03 VS0.29±0.04，0.42±0.04，0.48±0.03,0.55±0.04;0.55±0.04VS0.20±0.030.29±0.04,0.42±0.04,0.48±0.03;lipin-1α:0.54±0.02VS0.47±0.03,0.32±0.03,0.23±0.03,0.18±0.02;0.18±0.02 VS0.54±0.02,0.47±0.03,0.32±0.03,0.23±0.03;lipin-1β:0.11±0.02 VS0.32±0.02,0.39±0.02,0.44±0.02,0.54±0.03;0.54±0.03 VS0.11±0.02，0.32±0.02，0.39±0.02，0.44±0.02），差异均有统计学意义（F值分别为104.55，250.22，379.63，P＜0.01）。
　　1.3如Fig.3及Table3所示，随着造模时间延长，lipin-1β/α比值逐渐升高，正常对照组与实验组，16周组与其它各组比较（0.19±0.02 VS0.66±0.04，1.23±0.11,1.94±0.30,2.95±0.48;2.95±0.48 VS0.19±0.02,0.66±0.04,1.23±0.11，1.94±0.30，2.95±0.48），差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　2、Westren blot法检测SFRS10、总lipin-1、lipin-1α及lipin-1β的蛋白水平表达。
　　2.1如Fig.5及Table3所示，正常组大鼠肝组织中表达SFRS10较多，随着造模时间的延长，其表达量逐渐减少，正常对照组与实验组，16周组与其它各组比较（0.84±0.07 VS0.58±0.07，0.42±0.09，0.28±0.05;0.28±0.05 VS0.84±0.07，0.75±0.08，0.58±0.07，0.42±0.09），差异均有统计学意义（F值为66.53，P＜0.01），其中4周组与正常对照组相比（0.84±0.07 VS0.75±0.08），差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.2如Fig.6及Table3所示，正常组大鼠组织中总的lipin-1、细胞质lipin-1β及细胞核lipin-1α表达均较少，随着造模时间的延长，总的lipin-1和lipin-1β表达量均逐渐增多，lipin-1α表达逐渐减少。正常对照组与实验组，16周组与其它各组比较，总lipin-1:(0.25±0.06 VS0.41±0.07，0.52±0.05，0.77±0.10,0.85±0.05;0.85±0.05 VS0.25±0.06,0.41±0.07,0.52±0.05)，差异均有统计学意义(F值为99.60，P＜0.01)，其中16周与12周比较(0.85±0.05VS0.77±0.10)，差异有统计学意义(P＜0.05);lipin-1α:（0.59±0.05 VS0.44±0.05,0.31±0.03,0.17±0.02,0.10±0.03;0.10±0.03 VS0.59±0.05,0.44±0.05，0.31±0.03，0.17±0.02)，均有统计学差异(F值为177.14，P＜0.01);lipin-1β:0.13±0.03 VS0.25±0.05,0.39±0.03,0.69±0.05,0.74±0.05;0.74±0.05 VS0.13±0.03 VS0.25±0.05，0.39±0.03），差异均有统计学意义(F值280.47，P＜0.01)，其中16周与12周比较(0.74±0.05 VS0.69±0.05)，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:
　　1、酒精通过间接抑制SFRS10的表达从而影响lipin-1的表达及亚细胞定位，总的lipin-1及细胞质中lipin-1β的表达逐渐增多，细胞核中的lipin-1α的表达逐渐减少。
　　2、lipin-1的异常表达及重新分布导致肝细胞内脂质代谢紊乱而发生脂质沉积，这可能也是酒精性脂肪性肝病发生的重要机制之一。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 Lipin-1在酒精性脂肪肝病发病机理中的作用

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