36个氨基酸多肽对高脂饮食+CCl4诱导的非酒精性脂肪肝的保护性作用及机制研究

摘要

目的:随着现代人们生活饮食结构的变化，被称为现代“富贵病”的脂肪性肝病（也称脂肪肝）的发病率明显提高，已经成为仅次于病毒性肝炎的第2大高发性肝病，严重威胁着人类健康。脂肪性肝病的诱因有很多种，并且其病变主要集中在肝小叶，是常见的弥漫性肝病之一，以弥漫性肝细胞脂肪空泡样变为主要病理特征，可进展为肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭，因此对该病的早期诊断及治疗非常重要。非酒精性脂肪肝的治疗分为非药物治疗和药物治疗，前者仅适用于轻度脂肪肝患者，包括体育锻炼、减轻体重、控制饮食、去除病因等手段。然而，中重度脂肪肝患者无法通过非药物疗法有效清除肝脏脂肪，并且大多数降脂药物对肝内脂肪消除作用有限，许多降脂药可导致不同程度肝细胞损伤，因此降脂药在脂肪肝治疗中的作用和地位尚有争论。
　　本研究室前期寻找临床上早期肝炎诊断的生物标志物时运用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)从慢性肝炎患者血清中检测到的一个含量相对较高的36个氨基酸多肽。经本室进一步研究表明体外培养加入此多肽具有促进肝细胞增殖作用。
　　迄今为止，还没有关于该多肽在慢性脂肪肝模型中生理和病理作用的研究。根据本室前期研究成果，已经证实在免疫性肝损伤肝炎模型发挥一定的保护效果，我们推测其可能在脂肪肝这一慢性疾病的进展过程中同样发挥保护作用，所以进行本此研究。本研究利用高脂饮食加以四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤模型，研究该36个氨基酸多肽在慢性脂肪性肝病的治疗作用，并初步探讨其发挥作用机制，为下一步肝病治疗的临床应用提供实验理论依据。
　　方法:
　　1、将56只雄性SD大鼠随机分为模型组、正常对照组、西药组、中药组、36个氨基酸多肽低(100μg/kg)、中（200μg/kg）、高剂量（400μg/kg）组共7组。正常组在相应给药时点通过腹腔注射给予生理盐水并普通饲料进食，其余各组大鼠均通过腹腔注射10％ CCl4溶液每3天1次(3ml/kg)，高脂饮食喂养，持续4周。
　　将完成脂肪肝模型建立的56只大鼠，正常组在相应给药时点通过尾静脉注射生理盐水刺激，其余各组大鼠分别经灌胃给予复方甘草酸苷稀释液(120mg/kg)，降脂通络软胶囊稀释液(80mg/kg)或经尾静脉注射给予100、200、400μg/kg体重36个氨基酸多肽，每3天1次，持续治疗6周后，处死动物。收集大鼠血液，分离血清，检测各组血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)血清总胆红素(TB IL)、血清总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)水平，从血清学指标观察该多肽对高脂饮食加以四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤的治疗效果。
　　2、试验各组肝组织进行病理学检测，从病理学半定量观察该多肽对高脂饮食加以四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤的治疗效果。
　　3、肝组织采用苏丹黑B进行脂肪特殊染色，将不同剂量多肽治疗组与模型组、临床常见中药和西药治疗组进行对比，进一步确定该多肽对高脂饮食加以四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤的保护性作用。
　　4、通过免疫组化方法检测各组大鼠肝组织MCP-1的蛋白表达情况，从蛋白水平探讨该多肽在高脂饮食加以四氯化碳诱导大鼠慢性肝损伤过程中的作用机制。
　　5、通过分析病理学检测观察到肝细胞脂肪变性程度与肝组织MCP-1的蛋白表达的定性、定量结果相关性分析进一步证实36个氨基酸多肽发挥肝脏保护作用的机制。
　　结果:
　　1、试验各组血清学指标结果
　　与模型组相比，36个氨基酸多肽低、中、高剂量组、西药组、中药组及正常组血清ALT水平均显著低于模型组(P＜0.05);36个氨基酸多肽低、中剂量组及正常组血清AST水平均显著低于模型组（P＜0.05），并且多肽中剂量组血清AST水平与西药组有明显差异;36个氨基酸多肽低、中、高剂量组TBIL水平均显著低于模型组(P＜0.05);36个氨基酸多肽中剂量组血清CHOL水平均显著低于模型组(P＜0.01);36个氨基酸多肽低、中、高剂量组、西药组、中药组、正常组血清TG水平均显著低于模型组（P＜0.01）。
　　2、试验各组病理学检测结果
　　根据病理切片，按照通用标准评估肝脏的脂肪变性程度。结果显示，正常对照组大鼠肝组织中肝小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉和汇管区有序排列，形成肝索，脂肪变性程度0级;在模型组大鼠肝组织中出现大片脂肪空泡，＞75％肝细胞空泡样变，脂肪变性程度4级并且伴有淋巴细胞浸润;36个氨基酸多肽低、高剂量组、中药组:50％～75％肝细胞空泡样变，脂肪变性程度3级;36个氨基酸多肽中剂量组、西药组25％～50％肝细胞空泡样变，脂肪变性程度2级。
　　3、试验各组脂肪特殊染色结果
　　正常对照组肝细胞细胞膜被苏丹染色染成浅灰色，中央静脉和汇管区零星分布黑色点状颗粒（即着色的游离脂肪颗粒）;而在模型组中央静脉和汇管区位置可见接连成片状的黑色游离脂肪;中药组、多肽低剂量组和高剂量组在中央静脉区和肝实质部分均可见散状分布的着色脂肪颗粒，相较于模型组有所下降;西药组和多肽中剂量组冰冻切片显示，中央静脉区和肝实质部位相较于模型组显著下降。
　　4、试验各组肝组织MCP-1的蛋白表达结果
　　中药治疗组、西药治疗组、36个氨基酸多肽低、中、高组三个剂量组免疫组化结果总评分与模型组和正常对照组对比均有统计学差异(P＜0.05);中药治疗组、西药治疗组、36个氨基酸多肽低、中、高组三个剂量组免疫组化结果总评分之间差异无统计学差异（P＞0.05）。
　　5、病理学检测观察肝细胞脂肪变性程度与肝组织MCP-1的蛋白表达的定性、定量结果相关性分析
　　三个剂量多肽治疗组和西药组、中药组、正常对照组肝组织MCP-1的蛋白表达评分显著低于模型组(均P＜0.05)，HE染色脂肪空泡样变同MCP-1的蛋白表达量相关系数为0.474，P＜0.05，有统计学差异并且关联性较好。多肽治疗组肝组织MCP-1的蛋白的阳性细胞水平有所下降，并且肝细胞脂肪变性阳性细胞数越多，其肝组织MCP-1的蛋白的阳性细胞数同样越多，相关系数r=0.589，P＜0.05，有统计学差异。
　　结论:
　　1、外源性给予36个氨基酸多肽不仅能够降低脂肪肝大鼠血清ALT、AST、TBIL、CHOL、TG水平，还能够减少肝脏空泡样变，使肝细胞恢复正常，可有效治疗高脂饮食加四氯化碳诱导的大鼠脂肪肝。
　　2、外源性给予36个氨基酸多肽减轻高脂饮食加四氯化碳诱导的大鼠脂肪肝机制可能与抑制肝组织MCP-1的生成表达有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 36个氨基酸多肽给药对高脂饮食加以四氯化碳诱导的大鼠脂肪肝血清水平的影响

2 试验各组脂肪肝病理结果

3 试验各组脂肪特殊染色结果

4 试验各组MCP-1的蛋白表达情况结果

5 肝细胞脂肪变性程度与肝组织MCP-1的蛋白表达相关性分析

附图

讨论

结论

参考文献

综述 非酒精性脂肪肝的药物治疗进展及难题

致谢

个人简历