内质网应激对高果糖喂养大鼠胰岛功能的影响及机制研究

摘要

随着饮食及生活方式的转变，糖尿病已经成为继肿瘤和心脑血管病之后威胁人类健康的主要疾病，它可以导致心、脑、肾等多器官损害，并已成为患者致死致残的主要原因。国际糖尿病联盟(IDF)公布最新统计显示，2011年全球糖尿病患者大约有3.66亿，而到2030年，这一数字将达到5.52亿。我国2007-2008年糖尿病流行病学调查显示，糖尿病患病人数达到9720万，而糖尿病前期患病人数更是达到了1.45亿。而最新调查显示糖尿病患病率已达11.7％，糖尿病患者已超过1亿人。糖尿病的发生经过糖耐量正常、糖尿病前期以及糖尿病三个阶段。糖尿病前期患者是2型糖尿病的后备军，因此研究糖尿病前期的发病机制，寻找早期预防和治疗糖尿病前期的有效策略，对于提高人类的健康水平和生活质量，减少患者经济负担，具有重要的意义。
　　以往人们认为糖尿病前期的发病机制是以胰岛素抵抗为主。然而近年随着对胰岛β细胞研究的增加，越来越多的学者开始认识到胰岛β细胞功能和数量的下降在糖尿病前期向2型糖尿病的发生发展中起着重要作用。动物实验表明，db/db小鼠模型在血糖升高的过程中，其胰岛β细胞数量呈下降趋势。一项流行病学调查显示2型糖尿病患者在诊断之前10-12年胰岛功能就已经出现减低，并随着血糖的升高而下降，到诊断糖尿病时胰岛功能已经减少到正常的50％左右。而许多新发现的糖尿病前期患者如不采取任何干预措施3年内即可能转变成2型糖尿病，进一步的尸检发现糖尿病前期的患者胰岛β细胞数量大约是正常人的60％，而2型糖尿病患者则降至正常人的40％。
　　糖尿病发病的具体机制目前仍不清楚，但人们逐渐认识到不良的饮食习惯在2型糖尿病的发生发展中起着重要的作用。以前更多的研究集中在高葡萄糖和高脂饮食对引起糖尿病的胰岛素抵抗和胰岛功能的影响。而近年关于果糖对2型糖尿病的发生发展的影响也逐渐引起许多研究者的注意。由于果糖较普通蔗糖的口感优势以及人工果糖的大量的工业化生产使其价格下降，导致含大量果糖的饮料以及甜品的摄入量逐年增加，从而导致果糖摄入量增加。许多学者开始意识到高果糖饮食对于健康的影响。动物实验研究表明，高果糖饮食可以导致胰岛素抵抗，诱导脂质沉积，引起高甘油三酯血症、高胰岛素血症和高尿酸血症。因此被广泛用于糖尿病发病机制的研究。现有文献报道多集中于高果糖对胰岛素抵抗的影响，而对于是否导致胰岛功能的损害及其机制仍不明确。
　　许多研究已经证明糖脂毒性导致的应激反应，如氧化应激和内质网应激导致了胰岛功能的下降。胰岛β细胞的内质网用于合成大量的胰岛素。胰岛素抵抗状态下，胰岛素分泌量明显增加。但持续的胰岛素合成和分泌增加不能得到缓解就会引起β细胞的内质网应激。这会导致β细胞衰竭甚至死亡，数目减少，引起胰岛功能进行性下降，从而使糖耐量从正常到减低最后发展成糖尿病。许多研究已经证实，内质网应激在果糖导致的胰岛素抵抗中起着重要的作用，但是内质网应激是否参与果糖导致的胰岛功能下降的作用及其机制仍不明确。
　　本研究首先观察了糖调节受损合并高甘油三酯血症患者胰岛功能的改变，了解糖尿病前期糖脂毒性对胰岛功能的作用，进一步通过观察长期高果糖饮食导致胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性和胰岛功能变化，通过检测高果糖饮食喂养大鼠胰岛内质网应激相关的凋亡通路蛋白和基因的表达，观察胰岛功能的改变与内质网应激通路的关系，明确长期高果糖饮食是否导致胰岛功能下降以及在胰岛功能损伤中的危害和发生机制，并应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)对高果糖大鼠进行干预，初步探讨早期胰岛功能下降的治疗策略。
　　第一部分糖耐量减低合并高甘油三酯血症患者胰岛素敏感性和胰岛功能的研究
　　目的:观察糖耐量减低以及合并高甘油三脂血症患者胰岛素敏感性和胰岛功能的变化，探讨糖尿病前期糖脂代谢紊乱对胰岛素抵抗和胰岛功能的影响。
　　方法:选择2010年1月至2011年1月于河北省人民医院及沧州市中心医院内分泌科门诊就诊患者，年龄在20-65岁之间。根据1999年国际卫生组织(WHO)的糖耐量减低诊断标准:6.1mmol/L≤空腹血糖(FBG)＜7.0mmol/L并且葡萄糖耐量(OGTT)后7.8mmol/L≤糖负荷后2h(2 h BG)＜11.1mmol/L，诊断为糖耐量减低(IGT);根据美国第三次胆固醇教育计划诊断标准:甘油三酯(TG)＞2.3mmol/L，诊断为高甘油三酯血症。随机选取IGT患者40例为（IGT组），IGT合并高甘油三酯血症患者37例（IGT-HTG组）以及正常对照组(NGT组)40例。所有受试者均测量身高、体重计算体质量指数(BMI)。检测血FBG、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素(FPI)以及游离脂肪酸(FFA)。HOMA-IR评价胰岛素抵抗，HOMA-β评价基础胰岛功能。静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)评价第一时相胰岛素分泌(FPIR)。多组间比较采用完全随机的单因素方差分析，计数资料使用X2检验，比较3组间各指标的差异有无统计学意义。采用直线相关分析明确影响胰岛功能和胰岛素抵抗的因素。
　　结果:
　　1、各组一般临床资料的比较
　　3组间性别、年龄、BMI、TC、LDL-C、HDL-C以及血压均无明显差异(P＞0.05);与NGT组相比，IGT组和IGT-HTG组FBG、2 h-BG、HbA1c和FPI明显升高(P＜0.01，P＜0.05)，但在IGT组和IGT-HTG组之间没有明显差异(P＞0.05）;在IGT-HTG组TG和FFA明显高于IGT组和NGT组(P＜0.01，P＜0.05);
　　2、各组胰岛素抵抗以及胰岛功能评价指标的比较
　　IGT组和IGT-HTG组HOMA-IR显著高于NGT组，差异具有显著性(P＜0.01)，IGT组和IGT-HTG组间无显著差异(P＞0.05); IGT-HTG组HOMA-β显著低于NGT组和IGT组，差异具有显著性(P＜0.01)，IGT组和NGT组间无显著差异(P＞0.05); NGT组的FPIR显著高于IGT组和IGT-HTG组，具有显著性差异(P＜0.01)，而IGT组FPIR也显著高于IGT-HTG组，具有显著性差异（P＜0.05）。
　　3、相关性研究
　　Spearman相关性分析显示HOMA-β与FBG(r=-0.431，P=0.008)、HbA1c(r=-0.382,P=0.024)、FPI(r=-0.486,P=0.005)和TG(r=-0.305,P=0.034)成负相关;FPIR与2h-BG(r=-0.435，P=0.007)、HbA1c(r=-0.408，P=0.009)、FPI（r=-0.462，P=0.005）和TG（r=-0.438，P=0.006）成负相关。HOMA-IR与FBG(r=0.422,P=0.008)、2h-BG(r=0.427,P=0.007)、HbA1c(r=0.453,P=0.006)、FPI(r=0.487,P=0.005)和TG(r=0.394,P=0.015)成正相关。提示糖脂代谢紊乱参与了胰岛素抵抗和胰岛功能的损伤。
　　结论:
　　1、IGT患者存在胰岛素抵抗和胰岛功能的下降，而伴高甘油三酯血症患者胰岛素抵抗和胰岛功能的下降更加明显。
　　2、IGT患者胰岛功能下降与高血糖和高甘油三酯明显相关，表明糖脂代谢紊乱参与了胰岛素抵抗和胰岛功能的损伤。
　　第二部分高果糖饮食对大鼠胰岛功能和胰岛葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的影响
　　目的:高果糖饮食所致的胰岛素抵抗大鼠早期胰岛功能的变化及其发生机制。
　　方法:清洁级健康雄性Wistar大鼠90只，体重(180-200g)，购自河北医科大学实验动物中心控制在室温18～26℃，相对湿度40～70％，通风干燥、安静环境中喂养，每日12小时光照维持，昼夜循环。适应性饲养一周后分为正常对照组(NC)和高果糖组(HF)分别给予正常饲料和高果糖饲料喂养8周后，每组各取出6只应用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)测定血糖和血胰岛素计算HOMA-IR、HOMA-β和ΔI30/ΔG30评价胰岛功能，观察8周大鼠的生化指标（血脂、血糖）。分离和纯化大鼠胰岛Western-blot测定葡萄糖调节蛋白78(glucose related protein78，GRP78)蛋白水平。
　　结果:
　　1、两组大鼠体重及生化指标的变化
　　不同饮食喂养8周后，各组大鼠体重随着喂养时间的延长均有明显增加，但两组间的体重无显著差异(P＞0.01)。HF组空腹血糖较对照组无明显差异(P＞0.01)，但空腹胰岛素、胰岛素原以及血甘油三酯均明显高于NC组（P均＜0.01）。
　　2、两组大鼠胰岛素抵抗和胰岛功能的评价
　　与NC组相比，葡萄糖负荷后HF组30min、60min血糖显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）;HF组空腹胰岛素明显升高（P＜0.05），但胰岛素分泌高峰延迟。应用HOMA-IR、HOMA-β和ΔI30/ΔG30进一步量化评价胰岛素抵抗及胰岛功能显示，HF组HOMA-IR较NC组明显升高(P＜0.01)，反映早时相胰岛素分泌功能的ΔI30/ΔG30较NC组明显降低(P＜0.01)，但反映基础胰岛素分泌功能的HOMA-β与NC组相比无明显差异(P＞0.01);此外，HF组空腹血胰岛素原/胰岛素比值较NC组明显升高(P＜0.01)。表明高果糖喂养8周后出现了胰岛素抵抗、胰岛素的不适当分泌以及早时相胰岛素分泌功能的下降。
　　3、两组大鼠胰岛GRP78蛋白的表达变化
　　与NC组相比，HF组胰岛GRP78蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。提示高果糖喂养大鼠8周后胰岛出现了内质网应激。
　　结论:
　　1、高果糖喂养8周导致Wistar大鼠出现胰岛素抵抗和早期胰岛功能的下降。
　　2、高果糖喂养大鼠胰岛功能下降可能和内质网应激有关。
　　第三部分内质网应激及其介导的凋亡通路在高果糖饮食导致胰岛功能损害中的作用研究
　　目的:探讨长期高果糖饮食对大鼠胰岛β细胞凋亡影响，进一步明确内质网应激在其中可能的作用机制以及抑制内质网应激对胰岛功能的改善作用。
　　方法:自第9周开始本部分实验。正常组(NC)18只继续普通饲料喂养，HF组随机分为高果糖喂养对照组（HF-C组）18只和高果糖喂养加用4-苯基丁酸（4-PBA）治疗组(HF-PBA组)18只。从第9周起，HF-PBA组给予4-PBA0.5g/kg/d溶于蒸馏水中灌胃，每日一次。NC组和HF-C组给予等量的蒸馏水。4-PBA干预第8周末即实验第16周末，禁食12小时行OGTT试验后。以2.5％戊巴比妥(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后打开胸腹腔心脏采血处死大鼠，血液用于测定生化指标以及胰岛素和胰岛素原，于无菌条件下分离并取出胰腺，于胰腺尾部留取一部分置于4％多聚甲醛固定液中，充分固定以备进行TUNEL凋亡测定，一部分切成1mm长，置于2％戊二醛固定液备送电镜标本;剩余胰腺组织匀浆用于测定胰腺内TG含量。剩余大鼠胰腺组织用于提取胰岛细胞，-70℃冰箱冻存备用。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测胰岛XBP-1s mRNA的表达。Western blot方法检测胰岛内磷酸化的PERK、IRE1a、eIF2a、JNK蛋白以及凋亡蛋白CHOP、Bcl-2、Bax和caspase-12的表达。
　　结果:
　　1、大鼠体重的变化
　　喂养16周后，各组大鼠体重随着喂养时间的延长均有增加，HF-C组大鼠体重虽然略高于NC组和HF-PBA组，但三组间无显著差异(P＞0.01)。
　　2、大鼠空腹血糖、胰岛素以及胰岛素原的变化
　　喂养16周后，HF-C组空腹血糖较NC组和HF-PBA组略有升高，但三组间仍无显著性差异;HF-C组空腹胰岛素、胰岛素原继续升高，明显高于NC组(P＜0.01)，经4-PBA治疗后空腹胰岛素及胰岛素原都明显下降（P＜0.01）。
　　3、大鼠糖负荷后血糖及胰岛素的变化
　　与NC组相比，葡萄糖负荷后高果糖组30min、60min血糖进一步升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);应用HOMA-IR、ΔI30/ΔG30和HOMA-β进一步量化评价胰岛素抵抗及胰岛功能显示，HF-C组HOMA-IR较对照组明显升高（P＜0.01），胰岛素原/胰岛素、ΔI30/ΔG30和HOMA-β三项反映胰岛功能的指标较NC组均进一步下降（P均＜0.01），表明继续高果糖喂养8周后出现了胰岛素抵抗的加重和胰岛功能的进一步下降。给予4-PBA治疗8周后，HF-PBA组30min和60min血糖明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);与HF-C组相比，HF-PBA组HOMA-IR明显下降，胰岛素原/胰岛素、ΔI30/ΔG30和HOMA-β均明显升高，差异有统计学意义（P均＜0.01）。
　　4、血及胰腺组织TG的变化
　　与NC组相比，HF-C组血及胰腺组织匀浆TG明显增高（P均＜0.01），给予4-PBA治疗8周的HF-PBA组血及胰腺组织匀浆TG明显下降，差异有统计学意义（P均＜0.01）。
　　5、TUNEL技术测定胰岛β细胞凋亡率的变化
　　采用TUNEL试剂盒对各组胰岛凋亡细胞内DNA断段的末端进行标记，凋亡细胞的核染成棕褐色。HF-C组与NC组相比有大量TUNEL阳性细胞分布，分别为(38±4.2)％ vs（10±1.1）％，差异有统计学意义（P＜0.05）;与HF-C组相比，HF-PBA组TUNEL阳性细胞明显减少(15±1.8)％，差异均有统计学意义(P＜0.05）。
　　6、胰岛细胞电镜下的形态学变化
　　透射电镜下，在NC组可见细胞核呈卵圆形，核仁清晰，核染色质均匀。胞质内可见结构正常的粗面内质网，分泌颗粒呈圆形，期内可见电子密度致密芯，外有界膜包裹，芯与界膜之间存在间隙。胞浆内还可见散在线粒体。而在HF-C组出现胰岛细胞胞浆疏松，呈脱颗粒状态，成熟分泌颗粒减少，未成熟分泌颗粒增加。线粒体肿胀，内质网扩张。核周边染色质凝聚。4-PBA治疗后在HF-PBA组可见成熟分泌颗粒增多，线粒体肿胀以及内质网扩张改善。
　　7、4-PBA对内质网应激通路蛋白和基因表达的影响
　　与NC组相比，HF-C组GRP78蛋白表达进一步升高，差异有显著性（P＜0.01）;内质网应激信号通路中上游调节蛋白PERK的磷酸化蛋白(p-PERK)明显增加(P＜0.01)，其下游因子eIF2a的磷酸化(p-eIF2a)亦明显增加（P＜0.01）;另一条通路的上游调节蛋白IRE-1a的磷酸化(p-IRE-1a)明显增加(P＜0.01)，而与HF-C组相比，给予4-PBA干预后HF-PBA组PERK及其下游因子eIF2a，IRE1a的磷酸化蛋白表达均明显下降，均有显著性差异（P均＜0.01）。
　　与NC组相比，HF-C组胰岛XBP-1的剪切形式XBP-1s的mRNA水平显著增加，给予4-PBA干预大鼠XBP-1s的mRNA水平下降，与HF-C组相比差异有显著性（P＜0.01）。提示IRE1a激活了下游的XBP-1，导致XBP-1剪切进而引起ERS，而4-PBA通过IRE1a-XBP-1信号途径减少了ERS。
　　8、4-PBA对内质网应激介导的凋亡通路蛋白表达的影响
　　进一步检测3组内质网应激介导的凋亡标志物CHOP、caspase-12和JNK的磷酸化(p-JNK)，以及凋亡抗凋亡调节因子Bcl-2，Bax的蛋白表达发现，与NC组比较，HF-C组CHOP、caspase-12、p-JNK以及bax蛋白表达明显增加，差异均有显著性(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表达明显下降(P＜0.01);而与HF-C组相比，给予4-PBA干预后HF-PBA组CHOP、caspase-12、p-JNK以及bax蛋白表达明显下调，差异均有显著性(P＜0.01)，Bcl-2蛋白表达明显增加(P＜0.01)。
　　结论:
　　1、长期高果糖饮食导致Wistar大鼠胰岛β细胞出现内质网应激信号通路介导的凋亡以及胰岛功能的损伤。
　　2、4-PBA通过缓解内质网应激信号通路介导的胰岛β细胞凋亡改善了高果糖饮食大鼠胰岛功能。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 糖耐量减低合并高甘油三酯血症患者胰岛素敏感性和胰岛功能的研究

前言

对象与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 高果糖饮食对大鼠胰岛功能和胰岛葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 内质网应激及其介导的凋亡通路在高果糖饮食导致胰岛功能损害中的作用研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 糖脂毒性与胰岛功能研究进展

综述二 内质网应激信号通路与糖尿病

致谢

个人简历