miR-155对MST2的靶向抑制在血管重塑中的作用及机制

摘要

哺乳动物Ste20样激酶2（mammalian sterile20-like kinase2，MST2）作为Hippo通路的核心组件，在调节细胞增殖、生长和细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究利用小鼠股动脉损伤诱导的血管内膜增生模型，探讨MST2在miR-155介导的炎症和氧化应激发生发展中的作用，旨在为阐明miR-155在血管重塑中的作用机制以及药物开发研究提供实验基础。本文主要从以下几部分展开论述:
　　第一部分 miR-155促进血管平滑肌细胞增殖和血管内膜增生
　　目的:探讨miR-155对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及其在新生内膜形成中的作用。
　　方法:1.过表达或敲低血管平滑肌细胞中的miR-155，Western blot检测增殖标志基因，细胞计数、MTS测定细胞增殖。2.对miR-155基因敲除(miR-155-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠进行右则股动脉导丝损伤。苏木精-伊红染色（HE）观察和评价内膜增生的形态学改变。3.实时定量PCR(qRT-PCR)检测WT及miR-155-/-鼠股动脉损伤前后miR-155的表达。4.野生型小鼠股动脉损伤后原位过表达miR-155、原位转染miR-155激动剂及抑制剂，HE染色验证内膜增生的形态学改变。5.SM22α联合MAC2免疫双荧光染色观察平滑肌细胞增殖和巨噬细胞浸润。6.SM22α联合miR-155荧光探针原位杂交定位miR-155的表达。7.TUNEL染色和Westernblot检测过表达miR-155对血管平滑肌细胞凋亡的影响。
　　结果:
　　1.过表达和敲低miR-155分别促进或抑制体外培养的血管平滑肌细胞增殖。
　　2.miR-155遗传性缺失显著抑制导丝损伤所诱导的血管内膜增生。
　　3.原位过表达miR-155促进导丝损伤所诱导的血管内膜增生。
　　4.原位转染miR-155激动剂促进、转染抑制剂减少导丝损伤所诱导的血管内膜增生。
　　5.在损伤的血管中miR-155主要来源于平滑肌细胞。
　　6.过表达miR-155抑制H2O2诱导的血管平滑肌凋亡。
　　小结:
　　miR-155促进体外培养的血管平滑肌细胞增殖和抑制由H2O2诱导的细胞凋亡;遗传敲除miR-155显著降低导丝损伤诱导的血管内膜增生;miR-155功能获得或缺失实验均证实miR-155在血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成中发挥至关重要的作用。
　　第二部分 miR-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激，导致血管平滑肌细胞增殖和重塑
　　目的:揭示miR-155通过靶向抑制MST2进而促进炎症和氧化应激反应及导致血管平滑肌细胞增殖和血管重塑的作用机制。
　　方法:1.通过miRanda和RNAhybrid两网站对细胞增殖和迁移相关基因进行预测。2.合成靶基因3'非编码序列(UTR)及其突变体并连接到pmir-GLO双荧光报告质粒中，转染293A细胞并进行双荧光报告基因活性检测。3.血管平滑肌细胞中过表达或敲低miR-155，Western blot检测MST2和TRIM39的表达。4.对WT和miR-155-/-小鼠股动脉导丝损伤组织进行MST2和SM22α免疫双荧光染色。5.qRT-PCR检测损伤组织中炎症和氧化应激相关基因的表达。6.在血管平滑肌细胞中过表达miR-155的同时过表达MST2，检测MST2介导miR-155对血管平滑肌细胞增殖的影响。
　　结果:
　　1.在血管平滑肌细胞中MST2是miR-155的直接靶基因。
　　2.miR-155靶向抑制MST2促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移。
　　3.miR-155靶向抑制MST2促进NF-κB、TNF-α、p47phox和HO-1表达。
　　小结:
　　miR-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激相关基因表达，进而导致血管平滑肌细胞的增殖、迁移和血管重塑。
　　第三部分 miR-155通过靶向抑制MST2进而激活Raf-1-MEK-ERK1/2信号途径及整合炎症和氧化应激反应
　　目的:探索miR-155通过靶向抑制MST2从而调节炎症和氧化应激相关基因表达及平滑肌细胞增殖的信号传导途径。
　　方法:1.分别在血管平滑肌细胞中过表达或敲低miR-155，Westernblot检测与细胞增殖相关的信号通路及炎症和氧化应激相关基因表达。2.用siRNA敲低内源性MST2，检测细胞增殖相关的信号通路、炎症和氧化应激相关基因表达。3.过表达miR-155的同时敲低MST2，或抑制miR-155的同时敲低MST2，Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路、炎症和氧化应激相关基因表达。4.敲低内源性MST2后，分别用不同信号通路特异性抑制剂处理细胞，Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路、炎症和氧化应激相关基因表达。5.在血管平滑肌细胞中分别过表达或敲低miR-155后，免疫共沉淀检测MST2、MEK、Raf-1相互作用。6.报告基因检测NF-κB对miR-155启动子活性的影响。7.qRT-PCR检测损伤血管组织中PDGF mRNA的表达水平。
　　结果:
　　1.miR-155通过靶向抑制MST2而活化细胞增殖相关信号途径ERK1/2
　　在血管平滑肌细胞中分别过表达或敲低miR-155，Western blot检测与细胞增殖相关的信号通路。结果显示，过表达miR-155显著下调MST2表达并增加PI3K/Akt和ERK1/2的磷酸化，但不影响JNK和p38的磷酸化。相反，与转染对照miRNA相比，血管平滑肌细胞转染anti-miR-155后，ERK1/2的磷酸化水平显著下降;然而，PI3K/Akt、JNK和p38的磷酸化水平没有明显的改变。Western blot结果显示，在同时敲低MST2和miR-155的细胞中，ERK1/2的磷酸化水平升高，PI3K/Akt的磷酸化水平没影响， PCNA蛋白水平增加。与单纯过表达miR-155相比，当在血管平滑肌细胞中过表达miR-155的同时敲低MST2时， ERK1/2的磷酸化水平进一步增加。这些结果表明，miR-155通过靶向抑制MST2而活化ERK1/2信号途径，进而促进血管平滑肌细胞的增殖。
　　2.miR-155通过靶向抑制MST2表达整合炎症和氧化应激反应
　　Western blot结果显示，在血管平滑肌细胞中过表达miR-155可促进p47phox和NF-κB表达;与此相反，敲低miR-155下调这些蛋白质的表达。单纯敲低MST2使p47phox和NF-κB总蛋白及其磷酸化水平升高，但同时敲低MST2和miR-155时，则下调这些蛋白质的水平。相反，单纯过表达MST2使p47phox和NF-κB总蛋白及其磷酸化水平降低，但过表达MST2的同时也过表达miR-155时，又恢复了这些蛋白质的表达水平。这些结果表明，miR-155通过MST2来调节p47phox和NF-κB的表达，MST2将炎症和氧化应激反应整合在一起。
　　3.MST2通过Raf-1-MEK-ERK1/2信号通路促进miR-155介导的炎症和氧化应激反应。
　　在血管平滑肌细胞中过表达miR-155后进行免疫共沉淀分析的结果表明，与对照组相比，过表达miR-155显著增加Raf-1免疫沉淀复合物中MEK水平，降低MST2水平。相反， miR-155拮抗剂增加Raf-免疫沉淀复合物中的MST2，减少MEK。miR-155的过表达促进MEK和ERK/2磷酸化，而miR-155拮抗剂抑制这两种信号转导分子的磷酸化。
　　4.miR-155、NF-κB和PDGF之间形成正反馈环路
　　报告基因分析结果显示，与对照组相比，过表达NF-κB显著增加miR-155/BIC启动子的活性。同时，在血管平滑肌细胞中过表达NF-κB后，也显著增加miR-155基因的表达。对损伤的血管进行PDGF基因表达检测时发现，miR-155-/-小鼠PDGF基因的表达水平显著低于野生型小鼠，与原位转染Ad-GFP组相比，原位过表达miR-155能显著增加PDGF基因的表达水平。
　　小结:
　　miR-155靶向抑制MST2，减少MST2与Raf-1的相互作用，使Raf-1与MEK结合增加，进而激活ERK1/2信号通路，并整合炎症和氧化应激反应。
　　结论:
　　1.miR-155促进血管平滑肌细胞增殖和抑制细胞凋亡。
　　2.miR-155在血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成中发挥至关重要的作用。
　　3.在血管平滑肌细胞中MST2是miR-155的直接靶基因。
　　4.miR-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激相关基因表达，进而导致血管平滑肌细胞的增殖、迁移和血管重塑。
　　5.miR-155整合炎症和氧化应激反应是通过减少MST2与Raf-1的相互作用，增加Raf-1与MEK结合，进而激活ERK1/2信号通路。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 miR-155促进血管平滑肌细胞增殖和血管内膜增生

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 miR-155通过靶向抑制MST2促进炎症和氧化应激，导致血管平滑肌细胞增殖和重塑

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 miR-155通过靶向抑制MST2进而激活Raf-1-MEK-ERK1／2信号途径及整合炎症和氧化应激反应

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 典型的多功能miRNA：miR-155

致谢

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