复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠肾脏转化生长因子-β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达影响的实验研究

摘要

复荣通脉胶囊（冀药制字Z20070041）为沧州中西医结合医院院内中药复方制剂。复荣通脉胶囊作为益气养阴、活血通络法的经验方，我院临床上已广泛应用于糖尿病周围神经病变及周围血管病变的患者，在临床应用过程中发现疗效显著，对其他血管病变及慢性并发症也具有防治作用。为此我们设计了复荣通脉胶囊防治糖尿病慢性并发症系列课题，本研究为其分支研究课题。
　　目的:
　　通过观察复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)及骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达水平的影响，对复荣通脉胶囊干预糖尿病肾病进展的可能机制进行探讨，为临床上防治糖尿病肾病的应用提供理论依据。
　　方法:
　　将60只清洁级成年雄性Wistar大鼠随机分为两组，正常组(NC)10只，造模组50只。将大鼠禁食12h后造模，链脲佐菌素(STZ)以60mg/kg剂量进行腹腔注射;并将等量的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射到NC组大鼠。72h后尾静脉采血，要求糖尿病大鼠血糖值＞16.7mmol/L。造模成功后大鼠随机抽取40只，分为糖尿病组(DM，n=10)、复荣通脉胶囊低剂量治疗组(FRL，n=10)、复荣通脉胶囊中剂量治疗组（FRM，n=10）、复荣通脉胶囊高剂量治疗组(FRH，n=10)。成模后一周，中药治疗组剂量按人体-大鼠体表面积比值表换算出大鼠的等效剂量作为复荣通脉中剂量组，给予1.4g/（kg·d）灌胃;FRL组给予0.7g/(kg·d)灌胃，FRH组给予2.8g/(kg·d)灌胃，每日灌胃1次，连续8周。NC组和DM组每日给予同等剂量生理盐水灌胃。实验期间大鼠喂标准饲料，饮水自由，保持环境温度在22℃-26℃之间，不用胰岛素及其他降糖药物干预。灌胃治疗8周后，尾静脉取血测血糖，以3％戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部正中切口，腹主动脉采血，收集血标本。全自动生化分析仪检测各组大鼠血糖、肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）。测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平。取出大鼠双肾，将肾包膜及肾门结缔组织去除，先用生理盐水冲洗后称肾重，再置于4％中性福尔马林溶液中固定、脱水、石蜡包埋、切片厚4μm，采用免疫组化法检测骨形态发生蛋白-7(BMP-7)及转化生长因子β1(TGF-β1)。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin stainingHE)染色在光镜下观察肾小球及肾小管间质的病理变化。计量资料数据以(X)±S表示，各组间比较采用单因素方差分析，各组自身前后对照比较采用配对t检验，方差不齐时应用Dunntett T3法。计数资料用X2检验。所有数据用SPSS16.0软件统计处理，检验水准α=0.05。
　　结果:
　　1、大鼠一般状态
　　NC组大鼠精神好，眼睛有神，反应敏捷，毛发平整有光泽，肌肉充盈，体型适中;各DM组大鼠毛色暗黄无光泽，精神状态差，活动减少，摄食量、饮水量及尿量增多，体形消瘦。
　　2、肾重/体重比的变化
　　经灌胃治疗8周后，与NC组比较，DM组及FRL、FRM、FRH组肾重/体重比明显升高(P＜0.05);与DM组比较，FRL、FRM、FRH组肾重/体重比明显下降(P＜0.05);与FRL组比较，FRM、FRH组肾重/体重比明显下降(P＜0.05);FRM组与FRH组组间相比肾重/体重比无明显差别(P＞0.05)。
　　3、生化指标的变化
　　3.1 血糖的变化
　　造模前各组大鼠的血糖相比无差异（P＞0.05）。治疗前，与NC组相比，DM组及FRL、FRM、FRH组大鼠血糖均显著升高(P＜0.05);而DM组及FRL、FRM、FRH组各组间血糖相比无差异（P＞0.05）。经灌胃治疗8周后，各组血糖与治疗前相比无差异(P＞0.05);与NC组相比，DM组及FRL、FRM、FRH组大鼠的血糖显著升高(P＜0.05);DM组及FRL、FRM、FRH组各组间血糖相比无差异(P＞0.05)。
　　3.2 肾功能的变化
　　经灌胃治疗8周后，与NC组比较，DM组及FRL、FRM、FRH组各组大鼠血清肌酐、尿素氮水平明显升高(P＜0.05)。与DM组比较，FRL组血清肌酐、尿素氮水平无明显差异(P＞0.05)，而FRM、FRH组血清肌酐、尿素氮水平明显下降（P＜0.05）;与FRL组比较，FRM、FRH组血清肌酐、尿素氮水平明显下降(P＜0.05);FRM、FRH组间比较，血清肌酐、尿素氮水平无明显差异(P＞0.05)。
　　4、对肾脏组织的病理学观察
　　光镜下显示，NC组为肾小球血管袢薄而清晰，内皮细胞和系膜细胞数目正常，周围的肾小管也正常。DM组肾小球内皮细胞肿胀、系膜细胞增多;肾小管上皮肿胀，甚至坏死;肾间质有炎细胞浸润，血管扩张充血。FRL组肾小球内皮细胞增生、肿胀、系膜细胞数目增多;肾小管上皮肿胀，甚至坏死;肾间质有炎细胞浸润伴有血管扩张充血;FRM、FRH组肾小球内皮细胞和系膜细胞数目大致正常，内皮细胞稍肿胀，肾小管上皮形态正常，无肿胀、坏死;肾间质有散在炎性细胞浸润。
　　5、SOD与MDA的变化
　　5.1 SOD的变化经灌胃治疗8周后，与NC组比较，DM组及FRL、FRM、FRH组各组大鼠血清SOD水平明显下降(P＜0.05)。与DM组比较，FRL、FRM、FRH组各组大鼠血清SOD水平明显升高(P＜0.05)。与FRL组比较，FRM、FRH组血清SOD水平明显升高（P＜0.05）。FRM、FRH组间比较，血清SOD水平无明显差异(P＞0.05)。
　　5.2 MDA的变化经灌胃治疗8周后，与NC组比较，DM组及FRL、FRM、FRH组各组大鼠血清MDA水平明显升高(P＜0.05)。与DM组比较，FRL、FRM、FRH组各组大鼠血清MDA水平明显下降（P＜0.05）。与FRL组比较，FRM、FRH组血清MDA水平明显下降（P＜0.05）。FRM、FRH组间比较，血清MDA水平无明显差异（P＞0.05）。
　　6、大鼠肾脏BMP-7及TGF-β1的表达
　　6.1 BMP-7在正常大鼠肾脏组织中正常表达，与NC组比较，DM组及FRL、FRM、FRH组各组大鼠肾脏组织中BMP-7表达明显减少（P＜0.05）。与DM组比较，FRL、FRM、FRH组大鼠肾脏组织中BMP-7表达明显增多(P＜0.05)。与FRL组比较，FRM、FRH组表达明显增多（P＜0.05）。FRM、FRH组组间比较，表达无明显差异（P＞0.05）。
　　6.2 TGF-β1在正常大鼠肾脏组织中有少量表达，与NC组比较，DM组及FRL、FRM、FRH组各组大鼠肾脏组织中TGF-β1表达明显增多，有统计学意义(P＜0.05)。与DM组比较，FRL、FRM、FRH组大鼠肾脏组织中TGF-β1表达明显减少(P＜0.05)。与FRL组比较，FRM、FRH组表达明显减少（P＜0.05）。FRM、FRH组间比较，表达无明显差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、本研究复制的糖尿病大鼠模型经过8周后存在肾脏的损害。
　　2、复荣通脉胶囊对糖代谢无影响。
　　3、复荣通脉胶囊能够降低血尿素氮、肌酐的水平。
　　4、复荣通脉胶囊能够抑制糖尿病大鼠血清MDA水平的升高，并且能够抑制SOD水平的下降。
　　5、复荣通脉胶囊能够抑制糖尿病大鼠肾脏TGF-β1表达的上调，并且能够抑制肾脏BMP-7表达的下降。
　　6、本实验表明复荣通脉胶囊对糖尿病肾病通过以上机制有防治作用，但FRL组无此作用;FRM、FRH组均有防治作用，但治疗结果组间无明显差异，说明复荣通脉胶囊作用存在量效关系，但呈非线性关系。从药物经济学的角度考虑，中剂量为临床上合适的治疗剂量。

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 活血通络法治疗糖尿病肾病的理论及应用

致谢

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