利拉鲁肽对高脂喂养大鼠心肌组织自噬的影响及机制研究

摘要

自噬（Autophagy）意为自体吞噬，即细胞将自身的物质消化清除，它是一种依赖于溶酶体的保守的代谢途径，是一种基本的细胞代谢过程，主要降解并回收细胞内一些长寿命的蛋白质以及受损的细胞器，其作用主要是为了维持细胞的自身稳定[1]。自噬在维持细胞的生命活动中发挥着重要作用，它维持细胞的正常功能，以实现细胞代谢、细胞器更新的需要，是细胞内的一种自我保护机制，是机体应对体内外应激反应的机制之一。正常生理状态下的自噬若被抑制会导致体内有害物质的堆积，而过度的自噬又会破坏细胞的正常结构。因此自噬过度或者是不足均会造成细胞损伤。自噬作为一种普遍的生命现象，广泛参与了多种生理病理过程。因为自噬活性的改变在多种病理条件下都有重要意义，因此调控自噬可能成为某些人类疾病的潜在治疗靶点。
　　心肌细胞（CMs）是一种长寿命分裂后期细胞，分化再生能力有限，心肌细胞自噬对于维持心脏功能和活性具有重要的作用。在许多心脏疾病中都发现了蛋白质的聚集以及受损细胞器的堆积，比如高血压，心肌梗塞（MI）以及扩张型心肌病（DCM）[2,3]，说明在这些疾病中，自噬水平是不足的。研究表明自噬可影响心肌重构以及其它的心脏疾病，因此调控自噬可能成为心血管疾病防治的潜在靶点之一。有研究表明，高脂喂养的小鼠，其心肌纤维化的程度增加，并且自噬基因LC-3Ⅱ的水平下降，说明高脂饮食可能会导致心肌肥厚并使自噬水平降低。此外，高脂喂养24周的小鼠其心肌组织受到损害，同时心肌的自噬水平受到抑制。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是小肠L细胞分泌的一种生理性肽类激素，它可增加胰岛素的生物合成和分泌，刺激胰岛细胞的增殖和分化，具有多种生理学作用，正逐渐成为糖尿病治疗的热点。目前对于其研究已不仅局限于它对于胰腺的作用，多项研究表明GLP-1对胰腺及肾脏等重要器官都发挥着保护性的作用，同时在这些器官中观察到GLP-1与自噬水平的改变有关[4,5]，但其是否影响了心肌的自噬尚不清楚。为此，本研究将观察利拉鲁肽对高脂喂养大鼠心肌组织自噬水平的影响，并探讨其作用机制。
　　目的：观察利拉鲁肽对高脂喂养大鼠心肌组织自噬水平的影响，测定自噬相关分子Beclin1、LC-3Ⅱ、ATG7、p62的表达，以探讨利拉鲁肽对高脂状态下心肌自噬的影响及其机制发挥作用的可能机制。
　　方法:40只雄性健康SpragueDawldy（SD）大鼠（200-250g），适应性喂养1周后随机分为5组：正常对照组（给予普通饲料喂养），高脂对照组，高脂+利拉鲁肽低（0.4mg/Kg/d）、中（0.6mg/Kg/d）、高（0.8mg/Kg/d）剂量干预组（均给予高脂饲料喂养），每组8只大鼠。各个实验组分别皮下注射相应剂量的利拉鲁肽，正常对照组及高脂对照组给予等体积生理盐水。每周称量大鼠体重。实验12周后腹主动脉放血处死大鼠，收集血清测定血糖、血清甘油三酯（TG），总胆固醇（TC），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），血清BNP水平；Real-TimePCR检测心肌组织Beclin1、LC-3Ⅱ、ATG7、和p62的mRNA表达；Western-Blot检测心肌组织Beclin1、LC-3Ⅱ、AMPK、P-AMPK、mTOR和P-mTOR的蛋白表达。
　　结果：
　　1、利拉鲁肽对体重的影响：实验12周末，高脂对照组体重明显高于正常对照组（P＜0.05），利拉鲁肽低、中、高剂量组体重明显低于高脂对照组（P＜0.05），但是利拉鲁肽各剂量组体重差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　2、利拉鲁肽对血糖及血脂的影响：实验12周末，高脂对照组血糖明显高于正常对照组（P＜0.05），利拉鲁肽低、中、高剂量组明显低于高脂对照组（P＜0.05）；高脂对照组血清TG水平明显高于正常对照组（P＜0.05），利拉鲁肽低、中、高剂量组血清TG水平明显低于高脂对照组（P＜0.05）；高脂对照组血清TC较正常对照组升高但无统计学差异（P>0.05），利拉鲁肽低、中、高剂量组TC较高脂组降低，但只有高剂量组与其有统计学差异（P＜0.05）；高脂对照组血清LDL-C水平较正常对照组升高，HDL-C水平较正常对照组降低，均无统计学差异（P>0.05），利拉鲁肽各剂量组LDL-C较高脂对照组降低，HDL-C水平较高脂对照组升高，也均无统计学差异（P>0.05）。
　　3、利拉鲁肽对血清BNP的影响：实验12周末，与正常对照组相比较，高脂对照组的BNP水平明显增加（P＜0.05），利拉鲁肽组明显低于高脂对照组(P＜0.05），但是利拉鲁肽各剂量组间BNP水平差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　4、利拉鲁肽对心肌组织自噬相关分子的蛋白及基因表达的影响：实验12周末，高脂对照组Beclin1、LC-3Ⅱ蛋白表达明显下调（P＜0.05），利拉鲁肽各剂量组显著上调Beclin1、LC-3Ⅱ蛋白的表达（P＜0.05），Beclin1、LC-3Ⅱ基因表达同蛋白表达一致，高脂对照组ATG7的mRNA表达明显下调（P＜0.05），P62的mRNA表达明显上调（P＜0.05），利拉鲁肽各剂量组则与之相反。
　　5、心肌组织AMPK-mTOR通路信号分子的表达：AMPK及mTOR的蛋白在各组间没有差异（均P＞0.05）。与正常对照组相比，高脂对照组P-AMPK的蛋白表达显著下调（P＜0.05），P-mTOR的蛋白表达显著上调（P＜0.05），与高脂对照组相比，利拉鲁肽干预后P-AMPK蛋白表达显著上调（P＜0.05），P-mTOR蛋白表达显著下调（P＜0.05）。
　　结论：
　　1、高脂饮食可以使大鼠的心功能受损，表现为大鼠血清BNP水平的升高，利拉鲁肽干预后可以改善这种受损情况。
　　2、高脂饮食下调了心肌组织Beclin1，LC-3Ⅱ，ATG7mRNA的表达，上调了p62mRNA的表达，同时上调AMPK通路蛋白的表达，而利拉鲁肽干预可以改善这一状况。

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前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物及饲料

1.2 主要仪器

1.3 主要药品、试剂

2 实验方法

2.1 造模与分组

2.2 给药方法

2.3 标本采集方法

2.4大鼠血糖、血脂测定：利用全自动生化分析仪（HITACHI 7600-110，日本）测定。

2.5 心脏组织血清指标测定

2.6 心脏组织Beclin1、LC-3、p62、Atg7 mRNA表达测定（RT-PCR）

2.7 心脏组织AMPK、P-AMPK、m-TOR、P-mTOR、Beclin1和LC-3蛋白表达测定（Western Blotting）

2.8 统计学处理

结果

1 利拉鲁肽对体重的影响

2 利拉鲁肽对血糖及血脂的影响

3 利拉鲁肽对血清BNP的影响

4 利拉鲁肽对心脏组织自噬相关分子的表达

5 利拉鲁肽对心脏组织AMPK通路信号分子的表达

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:自噬与糖尿病

致谢

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