ATP水解酶对实验性矽肺小鼠的干预研究

摘要

目的：矽肺是由长期慢性吸入二氧化硅（silicondioxide，SiO2）粉尘引起的职业性肺疾病。由于起病隐匿、持续进展且没有有效的治疗手段，矽肺已经成为威胁发展中国家、特别是我国相关从业人员健康的非常严重的公共卫生问题。目前普遍认为，肺部巨噬细胞可以吞噬SiO2颗粒，释放一系列的炎症介质，在矽肺的发生发展过程发挥着重要的作用。而巨噬细胞具有异质性，本课题组前期研究表明，干预巨噬细胞表型偏移可以减轻矽肺早期炎症及晚期的纤维化表现。而胞外三磷酸腺苷（extracellularadenosinetriphosphate，eATP）作为机体各个系统细胞之间信息交流的重要分子和内环境的重要组成部分，可以影响巨噬细胞的表型极化。使用三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase，Apy）降解呼吸道ATP能否减轻矽肺小鼠的炎症和纤维化尚未明确。因此，本研究做出假设：使用Apy局部耗竭eATP可以通过调节单核巨噬细胞表型偏移，对矽肺的炎症和纤维化起到干预作用。
　　方法：
　　1、200只雄性C57BL/6J小鼠，随机分为矽肺造模组（silica组），生理盐水组（NS组），矽肺造模+溶剂对照组（Silica+NS组）及矽肺造模+Apy组（Silica+Apy），每组均为50只。2％异氟烷轻度麻醉小鼠后，silica组经口咽吸入SiO2悬浊液建立小鼠矽肺模型，NS组给予等体积生理盐水；Silica+Apy组在造模同时给予0.8μL0.5mg/mLApy，并在造模后4h重复给药一次，Silica+NS组给予等量的生理盐水。造模后3h、7d、14d、28d、56d按标准方法取材。灌洗组小鼠进行经气管肺泡灌洗，取肺泡灌洗液（BronchoalveolarLavageFluid，BALF）进行灌洗液细胞计数、细胞分类计数及相关细胞因子的ELISA检测，用流式细胞术检测外周血单核细胞、肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞表型；对非灌洗组右上肺进行病理学检测，分别进行HE染色，苦味酸-天狼星红染色，α-SMA、NLRP3+F4/80免疫荧光染色，左肺提取总RNA，进行IL-1β、CCL2、NLRP3、COLⅠ、COLⅢ表达量检测，右下中肺进行ATP含量检测。
　　2、取5只雄性C57BL/6J小鼠，颌下静脉丛取外周静脉血，分选流式分选出外周血单核细胞；小鼠经2%异氟烷麻醉后进行经气管肺泡灌洗，将肺泡灌洗液细胞及外周血单核细胞进行甩片、固定及破膜后进行P2X7R免疫荧光染色。
　　结果：
　　1、肺组织ATP检测表明，矽肺造模后肺组织ATP水平明显升高，给予Apy治疗后可以显著减低肺组织ATP的含量，达到局部耗竭ATP的目的。
　　2、7d肺组织HE染色及相应的炎症评分表明，与NS组相比，Silica组小鼠肺组织表现为大量炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽、破坏及炎症评分增高。BALF细胞计数表明，Silica组炎症细胞的总数、巨噬细胞、中性粒细胞数均显著升高，BALF上清IL-1β、CCL2蛋白水平及肺组织IL-1β、CCL2、NLRP3基因水平的表达量均显著增高，肺组织NLRP3+F4/80免疫荧光染色表明，矽肺小鼠肺组织NLRP3阳性巨噬细胞明显增多。而Silica+Apy组与Silica+NS组相比，肺组织炎症表现、炎症细胞的浸润明显缓解，IL-1β、CCL2、NLRP3基因蛋白水平的表达均下降。
　　3、28d肺组织苦味酸-天狼星红染色表明，Silica组小鼠肺组织在暗场可以观察到大量的粗大的红色胶原及细小的黄绿色胶原，基于苦味酸-天狼星红染色的半定量分析表明矽肺组胶原容积分数显著升高，肺组织α-SMA免疫荧光染色表明矽肺组α-SMA阳性细胞百分数显著增高，肺组织COLⅠ、COLⅢ的表达量增高；而Silica+Apy组与Silica+NS组相比，肺组织红色及黄绿色胶原区域、胶原容积分数、α-SMA阳性细胞百分数显著下降，COLⅠ、COLⅢ基因水平的表达量明显下调。
　　4、7d、14d造模后，相对于NS组，Silica组小鼠外周血单核细胞Ly6Chi亚群比例显著提高，肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞M2表型比例增高，而Apy干预可以显著逆转矽肺造模导致的上述单核巨噬细胞表型的偏移。
　　5、用流式细胞术成功分选出外周血单核细胞，对分选出的细胞进行的P2X7R免疫荧光染色表明，外周血单核细胞存在P2X7R的表达，对肺泡灌洗液的免疫荧光染色表明F4/80阳性巨噬细胞均存在P2X7R的表达。
　　结论：
　　Apy可以逆转矽肺小鼠外周血单核细胞、肺巨噬细胞表型偏移，减轻小鼠的早期炎症、晚期纤维化表现，该作用有可能是通过阻断ATP-P2X7R-NLRP3通路实现的。

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第一部分局部耗竭肺部ATP对实验性矽肺小鼠单核巨噬细胞亚型及炎症和纤维化干预作用的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分免疫荧光染色验证外周血单核细胞、肺巨噬细胞P2X7R的表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:单核巨噬细胞表型偏移在矽肺发生发展中作用的研究进展

致谢

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