雌激素激活PI3K-Akt通路抑制血管内皮细胞内质网应激凋亡

摘要

目的：明确雌激素对内质网应激(ERS)及过度的 ERS诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的抑制作用，并进一步研究其抑制作用的分子机制，以探讨雌激素对心血管的保护机制。
　　方法：⑴10μmol/l的衣霉素(Tunicamycin, TM)诱导 HUVEC10小时或2mmol/l的二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)诱导8小时，以构建ERS模型。通过检测葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein, GRP78)的表达，判断是否构建成功。提前给予10-8mol/l的17-β雌二醇(17β-estradiol, E2)预处理1小时，量化分析GRP78的变化，以探索E2对ERS的作用。⑵分别用TM/DTT诱导HUVEC6小时，Western blot检测ERS的三条主要信号通路蛋白，包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、转录激活因子-6(activating transcription factor6, ATF6)及需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme1, IRE1)通路蛋白的变化，以探索ERS最主要的信号通路，并进一步明确雌激素的抑制作用。⑶分别用TM/DTT诱导HUVEC10小时/8小时，Western blot检测ERS凋亡标志蛋白----C/EBP-同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)的变化。TM/DTT诱导HUVEC12小时，用Hochest染色检测细胞的凋亡率，探索E2对ERS凋亡的抑制作用。⑷分别添加10-7mol/l特异性E2受体拮抗剂ICI182,780和G15，检测磷酸化的PERK/PERK(p-PERK/PERK)的表达，探索雌激素受体在其抑制ERS中的作用。⑸分别添加10-5mol/l信号通路阻断剂，包括LY294002、SB203580、SP600125和 U0126，检测p-PERK/PERK的表达，探索雌激素抑制ERS的过程中激活的最主要的受体后信号通路。
　　结果：①TM(10小时)/DTT(8小时)诱导的HUVEC ERS组GRP78的表达量显著上调，而10-8mol/l的 E2可显著抑制其上调；②TM(6小时)/DTT(6小时)诱导的HUVEC ERS组，三条信号通路蛋白表达均明显上调,其中PERK信号通路的蛋白上调最显著，而10-8mol/l的E2可显著抑制其上调；③TM(10小时)/DTT(8小时)诱导的HUVEC ERS组, CHOP的表达量显著上调,且TM(12小时)/DTT(12小时)诱导组细胞ERS凋亡率显著增加，而10-8mol/l E2的预处理使上调明显回复，凋亡细胞减少；④E2有显著抑制 p-PERK/PERK上调的作用，而 E2的保护作用可分别被 ICI182,780和G15阻断，同时添加ICI182,780和G15时阻断作用最显著；⑤LY294002、SB203580、SP600125和U0126均可减弱E2抑制p-PERK/PERK上调的作用。LY294002----磷脂酰肌醇-3羟基激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)的阻断剂的作用最显著，而其本身对 p-PERK/PERK的表达无显著影响。
　　结论：⑴雌激素可以通过抑制PERK通路引起的ERS凋亡，保护血管内皮细胞，以达到防止动脉粥样硬化，保护心血管系统的作用。⑵雌激素抑制 ERS的机制主要是通过活化的雌激素受体激活PI3K-Akt信号通路实现的。

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要溶液配制

3 实验方法

结果

1 雌激素可直接抑制TM/DTT诱导的内质网应激

2 雌激素可显著抑制p-PERK/PERK蛋白上调

3 雌激素可抑制过度内质网应激引起的凋亡

4 雌激素受体调控雌激素对内质网应激凋亡的抑制作用

5 PI3K-Akt 通路可能为雌激素抑制内质网应激凋亡最主要的受体后信号通路

附图

讨论

结论

参考文献

综述: 雌激素防止动脉粥样硬化的机制探讨

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