EGFR-TKIs通过阻断AKT下调PD-L1在EGFR突变型非小细胞肺癌中的表达

摘要

目的：肺癌是全球范围内发病率和死亡率居首位的恶性肿瘤。对于晚期非小细胞肺癌，近年来继传统的放化疗外，分子靶向治疗和免疫治疗成为非小细胞肺癌治疗领域的最重要的手段之一，其个体化的精准性和高效性使之成为大家研究关注的焦点。其中作为比例最高的驱动基因靶点表皮生长因子受体（EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR），和免疫治疗靶点PD-1和PD-L1最为引人瞩目。分别针对性的靶向药物的抗肿瘤效果在体外和体内试验中已得到充分的验证。既往部分研究发现，EGFR信号通路与PD-1/PD-L1之间存在某种联系，本研究旨在进一步确定二者之间的相关性及机制，以及EGFR-TKIs是否通过阻断EGFR通路抑制肿瘤增殖同时对PD-L1表达产生影响。
　　方法：
　　1、细胞培养使用含有10％胎牛血清的1640培养基常规传代培养HCC827细胞，并置于含有5%C02、95%、37℃湿度的恒温培养箱中培养。
　　2、MTT法检测一定浓度梯度厄洛替尼对人非小细胞肺癌细胞HCC827增殖的抑制作用，然后检测药物作用24h后HCC827细胞活性，并且计算药物半数抑制浓度（IC50），绘制生长曲线图。
　　3、应用流式细胞仪检测生长因子EGF刺激HCC827前后及厄洛替尼作用细胞后PD-L1表达的情况。
　　4、应用Transwell实验技术检测生长因子EGF刺激HCC827前后和厄洛替尼作用于HCC827细胞前后，肺癌细胞的转移能力的变化情况。
　　5、应用流式细胞仪检测生长因子EGF刺激HCC827细胞前后以及厄洛替尼作用于HCC827细胞后,肺癌细胞凋亡的情况。
　　6、应用qRT-PCR技术检测生长因子EGF刺激HCC827细胞前后及厄洛替尼作用于HCC827细胞后，EGFR、PD-L1基因的mRNA表达的情况。
　　7、应用Western-blot的方法分别检测厄洛替尼和AKT抑制剂作用于细胞后，其AKT、p-AKT、p-EGFR、PD-L1蛋白的表达水平
　　8、统计学方法：应用SPSS13.0进行数据处理，计量资料采用x±s或M±QR表示,以单因素方差多组比较分析统计分析，LSD法用于进行各组之间两两比较，并且以P<0.05为有统计学意义。
　　结果：
　　1、MTT法检测厄洛替尼对肿瘤细胞增殖的抑制作用HCC827细胞
　　HCC827细胞培养到对数期后，给予厄洛替尼处理，设置厄洛替尼0.001uM组、0.01uM组、0.1uM组、1uM组、10uM组，分别药物作用于细胞24h后细胞的活性为：82.83±2.58%、71.44±2.10%、45.54±1.04%、35.02±2.47%、29.14±1.35%，IC50为0.136uM，并且随着药物浓度增加，细胞活性呈逐渐降低状态，具有剂量依赖性（P＜0.05）。
　　2、应用流式细胞仪检测细胞膜表面分子PD-L1表达
　　A组（空白对照）、B组（EGF刺激组）、C组（TKI组）其PD-L1的表达量分别为57.62±0.67%、74.74±1.69%、35.53±0.90%；A组、C组与B组均有统计学差异（P＜0.05）。
　　3、应用qRT-PCR法检测厄洛替尼和EGF对肿瘤细胞的EGFR、PD-L1基因表达情况的影响。
　　A组（空白对照）、B组（EGF刺激组）、C组（TKI组）其EGFR的表达量分别为：1.05±0.26、1.70±0.14、0.44±0.07；其PD-L1的表达量分别为：1.05±0.13、1.79±0.12、0.64±0.08；B组与A组、C组与B组比较均有显著性差异（P＜0.05）。
　　4、Transwell小室侵袭实验检测厄洛替尼和EGF对肿瘤细胞转移的影响
　　A组（空白对照）、B组（EGF刺激）、C组（TKI组）其转移的细胞数为123±9.89、248.33±16.21、46.33±8.50，B组与A组、C组与B、B组与A组比较均有显著性差异（P＜0.05）。
　　5、流式细胞术检测厄洛替尼和EGF对肿瘤细胞凋亡的影响
　　A组（空白对照组）、B组（EGF刺激组）、C组（TKI组）其细胞凋亡率分别为3.10±0.66%、2.20±1.09%、18.78±1.42%，C组与A组、B组有显著差异（P＜0.05）A组与B组无显著性差异（P>0.05）。
　　6、应用Western-blot的方法检测厄洛替尼和AKT阻断剂对pAKT、pEGFR、PD-L1蛋白表达的影响
　　第一部分A组（空白对照）、B组（1.0uM/AKT阻断剂）、C组（2.0uM/AKT阻断剂）其pAKT的表达量分别为：0.87±0.08、0.74±0.04、0.51±0.04；B组与A组、C组与B组比较均有显著性差异（P＜0.05）。其PD-L1的表达量分别为：1.40±0.07、0.97±0.07、0.62±0.15；B组与A组、C组与B组均有显著性差异（P＜0.05）。第二部分A组(空白对照组)、B组（0.1uM/Erlotinib）、C组（0.2uM/Erlotinib）其pEGFR的表达量为：0.87±0.08、0.47±0.07、0.19±0.04；B组与A组、C组与B组比较均有显著性差异（P＜0.05）。其PD-L1的表达量分别为：1.17±0.11、0.50±0.03、0.12±0.03；B组与A组、C组与B组均有显著性差异（P＜0.05）。
　　结论：
　　1、厄洛替尼可抑制HCC827细胞的活性和增殖能力，且有浓度依赖性。
　　2、EGFR通路介导调控PD-L1的表达。
　　3、厄洛替尼抑制HCC827细胞的侵袭能力。
　　4、厄洛替尼提高HCC827细胞凋亡率。
　　5、EGFR通路调控PD-L1表达至少是部分通过下游AKT信号通路。

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前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 应用 MTT法检测厄洛替尼对HCC827肿瘤细胞增殖的抑制作用

2 应用流式细胞仪 检测细胞表面分子PD-L1的表达情况

3 Transwell小室侵袭实验检测厄洛替尼对肿瘤细胞转移的影响

4 应用qRT-PCR法检测厄洛替尼和EGF对肿瘤细胞的EGFR、PD-L1基因表达的影响

5 流式细胞术检测厄洛替尼和EGF对肿瘤细胞凋亡的影响

6 应用Western-blot的方法检测厄洛替尼和AKT阻断剂对 pAKT、pEGFR、PD-L1蛋白表达的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: PD-1/PD-L1信号通路及其阻滞剂在非小细胞肺癌（NSCLC）中的研究进展

致谢

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