EZH2和H3K27me3在食管鳞状细胞癌中的表达及对食管癌细胞侵袭能力的影响

摘要

食管癌（Esophageal carcinoma, EC）是世界上最常见的癌症类型之一。食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC）和腺癌（Esophageal Adenocarcinoma, EA）是食管癌最常见的两种类型。西方国家食管腺癌较多，而在中国食管鳞状细胞是其中最主要的组织学类型。尽管在治疗食管鳞状细胞癌方面，外科手术、放疗及化疗已经取得的很大的进步，但是食管鳞状细胞癌患者五年生存率仍不理想。晚期食管鳞状细胞癌患者预后较差生活质量较低。因此，迫切的需要一个可靠的生物标志物来识别伴有高度不良预后的患者，并且指导其治疗。
　　已经报道表观遗传改变，包括DNA甲基化及组蛋白共价修饰，涉及各种肿瘤基因的沉默，促进肿瘤发生或者人类癌症的进展。其中最重要的机制是通过EZH2沉默许多癌症相关基因，EZH2可以使靶基因启动子处组蛋白H3赖氨酸K27发生三甲基化。本研究利用免疫组织化学法分别检测 EZH2及 H3K27me3在食管鳞癌组织和相应正常食管组织中的表达及与其临床生物学指标之间的关系，及与患者预后关系。并通过实时荧光定量RT-PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）、Western-blot方法检测EZH2及H3K27me3在食管癌细胞系中的表达，并通过Transwell侵袭小室及细胞划痕实验探讨了EZH2对食管癌细胞侵袭和迁移的影响，以期为 EZH2及 H3K27me3作为判断患者不良预后的指标提供理论依据。主要研究内容和结果如下：
　　第一部分 EZH2和H3K27me3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及对预后的意义
　　目的：
　　探讨EZH2和 H3K27me3在食管鳞状细胞癌组织，相应正常组织中的表达及与其临床生物学指标之间的关系，尤其是与预后关系。
　　方法：
　　1、实时定量PCR方法检测96对食管鳞状细胞癌及其癌旁组织中EZH2mRNA的表达。
　　2、应用免疫组织化学法检测96例食管鳞状细胞癌组织及相应正常组织中 EZH2和 H3K27me3蛋白的表达，分析其与患者临床生物学指标及其预后的关系。
　　结果：
　　1、食管鳞状细胞癌标本EZH2 mRNA水平明显高于癌旁组织。96例食管鳞状细胞癌组织中EZH2的阳性率为84.4％(81/96)；而相应癌旁组织中EZH2高表达占51.0%(49/96)。
　　2、EZH2和 H3K27me3蛋白在食管鳞状细胞癌组织中表达阳性率明显高于癌旁组织。在食管鳞状细胞癌细胞中，EZH2在细胞质和细胞核中均有表达，但是 H3K27me3则仅表达在细胞核中。EZH2和 H3K27me3在食管鳞状细胞癌癌旁组织表达阳性率分别占44.8%(43/96)和26.0%(25/96)，低于食管鳞状细胞癌组织70.8%（68/96）和47.9%（46/96）。
　　3 EZH2和 H3K27me3表达与食管鳞状细胞癌患者病理学特征的关系。EZH2蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤分期不相关(P?0.05)。EZH2蛋白的表达与食管鳞状细胞癌患者组织学分级、淋巴结转移及远位转移呈正相关(P＜0.05)。H3K27me3蛋白表达与患者的年龄、性别、肿瘤部位、及肿瘤分期无关(P?0.05)。H3K27me3蛋白表达与食管癌患者组织学分级、淋巴结转移及淋巴结远位转移呈正相关(P＜0.05)。
　　4 EZH2和 H3K27me3表达与食管鳞状细胞癌患者总生存期间的关系。Kaplan-Meier生存数据显示EZH2表达阳性患者的平均生存期41.175个月，明显短于EZH2表达阴性患者(54.166个月)(χ2=13.218, P=0.000)。同样，H3K27me3表达阳性的患者平均生存期38.677个月，明显短于H3K27me3表达阴性患者(50.800个月)(χ2=15.990, P=0.000)。EZH2和H3K27me3表达均阳性的患者平均生存期为36.136个月，明显短于仅有一种蛋白阳性患者(48.027个月)或者两个蛋白均阴性患者(55.627个月)。
　　5 Cox回归分析数据表明EZH2表达(HR,3.574;95%CI,1.742-7.331;P=0.001)、组织学分级(HR,2.042;95%CI,1.200-3.475;P=0.008)及淋巴结远位转移(HR,8.667;95%CI,4.280-17.547;P?0.001)是影响食管鳞状细胞癌患者预后的独立因素。尽管 H3K27me3并没有显示出是影响食管鳞状细胞癌患者独立的预后因素，但是共表达 EZH2和 H3K27me3与食管鳞状细胞癌患者远位转移呈正相关(χ2=15.681;P=0.000)。
　　结论：
　　EZH2和 H3K27me3可以作为食管鳞状细胞癌患者预后不良的生物标志物。
　　第二部分 EZH2和H3K27me3在食管鳞状细胞癌细胞株中的表达及其对食管癌细胞侵袭能力的影响
　　目的：
　　检测食管癌细胞株KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109细胞中EZH2的表达，并通过转染 EZH2过表达载体或 shEZH2载体研究 EZH2与H3K27me3的关系及对食管癌细胞侵袭能力的影响。
　　方法：
　　1应用 qRT-PCR、Western Blot方法检测食管癌细胞株 KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109中EZH2的表达情况。
　　2应用 qRT-PCR、Western Blot方法检测食管癌细胞过表达/沉默EZH2对H3K27me3基因表达水平的影响。
　　3应用qRT-PCR分析食管癌细胞过表达/沉默EZH2对MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9基因表达水平的影响。
　　4通过划痕实验分析过表达/沉默 EZH2后食管癌细胞的迁移运动能力。
　　5通过Transwell实验分析过表达/沉默EZH2后食管癌细胞的侵袭能力。
　　结果：
　　1 qRT-PCR及Western Blot结果显示Eca109及 TE1细胞中EZH2和H3K27me3明显高于KYSE30及 KYSE170细胞中EZH2和 H3K27me3表达水平（P＜0.05）。
　　2 Western Blot结果显示过表达EZH2质粒的KYSE30和 KYSE170食管癌细胞系中H3K27me3蛋白的表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。
　　3 Western Blot结果显示EZH2沉默组的Eca109及 TE1食管癌细胞系中H3K27me3蛋白的表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。
　　4 qRT-PCR结果显示 KYSE30和 KYSE170食管癌细胞转染 EZH2后MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9 mRNA水平较对照组相比明显升高（P＜0.05）。Transwell侵袭实验显示 KYSE30及KYSE170转染 EZH2组侵袭能力显著高于对照组（P＜0.05）。细胞划痕实验显示与对照组相比转染EZH2组KYSE30及KYSE170细胞迁移能力明显增强（P＜0.05）。
　　5 qRT-PCR结果显示ShEZH2质粒转染Eca109和TE1食管癌细胞系后MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9 mRNA水平较对照组相比明显降低（P＜0.05）。Transwell侵袭实验表明Eca109和TE1细胞转染ShEZH2质粒组穿过Transwell侵袭小室细胞数显著低于对照组细胞数（P＜0.05）。细胞划痕实验显示与对照组相比转染ShEZH2质粒组Eca109和TE1细胞迁移能力明显降低（P＜0.05）。
　　结论：
　　EZH2可增加靶基因启动子上组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化，并且EZH2促进了食管癌细胞的侵袭能力。

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引言

第一部分EZH2和H3K27me3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及对预后的意义

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分EZH2和H3K27me3在食管鳞状细胞癌细胞株中的表达及其对食管癌细胞侵袭能力的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:组蛋白甲基转移酶EZH2在肿瘤中的作用

致谢

个人简历