干扰素α联合化疗药对乳腺癌细胞株协同抗增殖作用及机制研究

摘要

目的：乳腺癌在世界范围内发病率呈逐年上升趋势，现已居在我国女性恶性肿瘤之首，是威胁女性健康的重要因素。从20世纪70年代美国肿瘤学家Fisher提出乳腺癌是一种全身性疾病，乳腺癌的全身综合性治疗开始得到重视，形成了一种以局部治疗为主，同时联合放化疗及内分泌治疗为辅的综合治疗模式。近年来，随着人们对肿瘤生物学特性研究的不断深入，生物治疗逐渐被提升至重要地位，主要包括靶向治疗、基因治疗、免疫细胞治疗等。干扰素α（interferon alpha，IFN-α）作为应用较早的免疫调节因子，同时也较早的应用于肿瘤临床治疗，现已用于治疗14种以上类型的肿瘤，且具有良好的效果及较小的毒副反应，但尚未应用于乳腺癌。本文通过研究干扰素α联合化疗药作用于乳腺癌细胞株，探究两者之间是否具有协同抗增殖作用，继而进一步研究其相关基因表达变化，初步探讨干扰素α联合化疗药抗肿瘤增殖机制。此研究以期为干扰素α作为一种免疫调节因子在乳腺癌综合治疗方面提供理论依据。
　　方法：首先以不同浓度干扰素α和化疗药阿霉素（adriamycin，ADM）、顺铂（ cis-diamine dichloroplatinum， CDDP）作用于乳腺癌细胞株MDA-MB-453、MDA-MB-231、MCF-7、BR3、HCC-1937，采用水溶性四唑盐（WST-8）比色法在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值，绘制细胞增殖曲线，从而计算出细胞增殖情况，比较不同乳腺癌细胞株对干扰素α抗增殖作用的敏感度；然后选取对干扰素α抗增殖作用较为敏感的细胞株，将干扰素α及化疗药物联合作用96h后，采用WST-8比色法在酶联免疫检测仪OD450nm处测量各孔的吸光值，通过CalcuSyn软件检测干扰素α同化疗药联合作用于乳腺癌细胞时两者之间是否具有协同作用，基于WST结果计算结合指数（combination index，CI）和单独成分影响值（fractions affected，Fa），CI＜1、CI＝1、CI＞1分别表达两者之间具有协同、相加、拮抗作用；选取干扰素α同化疗药联合作用下具有协同作用的分组，通过流式细胞仪检测细胞增殖的周期分布变化情况；应用实时荧光定量技术（ quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测干扰素α和化疗药物单独作用及联合作用后Bax、Cyt-c、TRAIL的变化。
　　结果：
　　1干扰素α、ADM、CDDP对乳腺癌细胞株的抗增殖作用
　　将乳腺癌细胞株 MDA-MB-453、MDA-MB-231、MCF-7、BR3、HCC-1937于96孔板培养，分别以不同浓度干扰素α（0、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml）、不同浓度ADM（0、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM）、不同浓度CDDP（0、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM）处理。培养96h后应用 WST-8比色法检测每种细胞株不同作用浓度下细胞增殖情况。结果显示：各浓度的干扰素α对乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231的抗增殖作用较为明显，且在给定浓度范围内（0-1000ng/ml）随干扰素α浓度增加其抗增殖作用增强，同对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）；同浓度下的干扰素α对乳腺癌细胞株 MCF-7的抗增殖作用较 MDA-MB-453、MDA-MB-231敏感，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；不同浓度的干扰素α对乳腺癌细胞株BR3、HCC-1937抗增殖作用不明显，同对照组相比差别无统计学意义（P＞0.05）；不同浓度的ADM和CDDP对不同乳腺癌细胞株均具有抗增殖作用，且抗增殖效果均随药物浓度增加而增强，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　2干扰素α联合ADM或CDDP对乳腺癌细胞株MCF-7的抗增殖作用具有协同效应
　　以无处理组的乳腺癌细胞株 MCF-7细胞增殖活性为100％，将细胞分为横向干扰素α浓度梯度（0、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml），纵向ADM/CDDP浓度梯度（ADM：0、0.003μM、0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM；CDDP：0、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM），培养96h后应用WST-8比色法检测不同药物配比浓度下细胞增殖抑制情况，绘制细胞增殖曲线，经CalcuSyn软件分析，干扰素α联合化疗药ADM联合作用于乳腺癌细胞株MCF-7时，Fa在0.2-0.8时，CI＜1，表明两者同时作用于MCF-7时具有协同抗增殖作用；干扰素α联合化疗药CDDP联合作用于乳腺癌细胞株MCF-7时，Fa在0.2-0.8时，CI
　　＜1，表明两者同时作用于MCF-7时具有协同抗增殖作用。
　　3干扰素α联合ADM或CDDP诱导乳腺癌细胞株MCF-7的周期变化
　　以无处理组为空白对照，分别以干扰素α（300ng/ml）、ADM（0.03μM）、CDDP（0.3μM）作用于乳腺癌细胞株MCF-7细胞96h后，收取固定细胞，经流式细胞仪分析，三组细胞中subG1期比例较对照组升高，（分别为对照组2.85%，干扰素α组13.83%、ADM组7.98%、CDDP组8.53%），差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示在设定浓度下，干扰素α、ADM、CDDP均具有诱导肿瘤细胞凋亡作用。以干扰素α分别联合 ADM或CDDP，及干扰素α预处理后（间隔12h）联合ADM或CDDP作用于乳腺癌细胞株MCF-7细胞，培养96h后，收取细胞固定，经流式细胞仪检测，联合作用组细胞中 subG1期比率均较单一用药组增高（分别为干扰素α联合ADM组29.49%，干扰素α先于ADM组26.79%、干扰素α联合CDDP组25.17%，干扰素α先于CDDP组26.11%，与对照组及单一药物组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　4干扰素α联合化疗药可调节乳腺癌细胞株MCF-7中Bax、Cyt-C、TRAIL表达水平
　　以无处理组为空白对照，分别以干扰素α（300ng/ml），CDDP（0.3μM），干扰素α联合CDDP，及干扰素α预处理（间隔12h）后联合CDDP作为分组，作用于乳腺癌细胞株MCF-7细胞，培养96h后，提取RNA反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测Bax、Cyt-C、TRAIL水平。结果显示干扰素α组联合CDDP组及干扰素α预处理后联合CDDP组中，Bax、Cyt-C水平较单一用药组及空白对照组显著上调，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明干扰素α同CDDP联合应用可通过上调Bax表达增加Cyt-C的释放，从而增强线粒体凋亡途径；在联合组中TRAIL的表达同样增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示干扰素α同 CDDP联合应用可以上调TRAIL的表达从而激活死亡受体（Fas-FasL）介导的凋亡途径。
　　结论：
　　1干扰素α在不同乳腺癌细胞株中抗增殖活性不同，其中对 MCF-7细胞株的抗增殖作用较为明显，且一定范围内具有剂量依赖性。
　　2干扰素α联合ADM或CDDP可显著增强化疗药对MCF-7细胞株的抗增殖作用，且两者具有协同作用。
　　3干扰素α联合ADM或CDDP可诱导乳腺癌细胞株MCF-7 subG1期增加。
　　4干扰素α可上调乳腺癌细胞株MCF-7中Bax、Cyt-C、TRAIL的表达，提示通过激活线粒体凋亡途径和死亡受体介导的凋亡途径，从而诱导癌细胞凋亡，同CDDP联合应用时可增强化疗药的诱导凋亡作用。

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前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 干扰素α、化疗药ADM、CDDP对乳腺癌细胞株的抗增殖作用

2 干扰素α联合化疗药ADM或CDDP对乳腺癌细胞株MCF-7的抗增殖作用具有协同效应

3 干扰素α联合化疗药ADM或CDDP诱导MCF-7细胞株subG1期增加

4干扰素α联合化疗药可调节乳腺癌细胞株MCF-7中Bax、Cyt-C、TRAIL表达水平

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 干扰素α的研究进展

致谢

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