β-catenin介导GLP-1受体激动剂改善高果糖诱导的肝脏脂质沉积的研究

摘要

非酒精性脂肪性肝病（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其病理学改变与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细胞癌。流行病学资料证实，非酒精性脂肪性肝病已成为2l世纪全球重要的公共健康问题之一，但目前仍无特效治疗，有待于针对其发生发展机制的新药物的开发。
　　近年，果糖在西方国家人群的摄入逐年增加；而在我国，随着西方化饮食习惯对国民的影响，可乐、果汁等的消耗量明显增加。NAFLD的发生与不良的饮食习惯，尤其是果糖的大量摄取有关。应用高果糖饮食建立肝脏脂质沉积动物模型来观察药物对其影响具有一定现实意义。在我们课题组的前期研究中，高果糖喂养可使啮齿类动物出现肝脏脂质沉积，成功诱导出大鼠及小鼠的肝脏脂质沉积模型，并发现肝内源性甘油三酯生成增多是高果糖致肝脏脂质沉积的主要机制。因此，本研究选取的模型为高果糖诱导的肝脏脂质沉积模型。
　　抑胃多肽（gastric inhibitory polypeptide，GIP）和胰高血糖素样肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）是肠促胰岛素两种主要活性多肽。目前基于 GLP-1的两类药物包括 GLP-1受体激动剂和二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制剂，逐渐研发上市作为新型降糖药物日益被关注。人们发现 GLP-1受体在人体内分布广泛，GLP-1在人体内的生物学作用非常广泛。2010年 Gupta等首次证明了人类原代肝细胞上存在GLP-1受体，使研究GLP-1与肝脏的作用具有了生物学基础。之后陆续有临床、动物及细胞研究发现 GLP-1能改善肝脏脂质沉积，但具体机制尚不明确。
　　β-catenin的功能主要为介导细胞间黏附和参与基因的表达。作为wnt信号途径的核心分子β-catenin越来越受到人们的关注，近年来发现该通路与肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病以及代谢综合征的发生发展也密切相关。动物实验表明敲除β-catenin基因的小鼠肝脏出现脂质沉积。而且随着研究的深入人们发现β-catenin对GLP-1的生成和功能发挥起着重要作用。但目前尚无GLP-1与β-catenin在非酒精性脂肪肝发生发展中相互关系的研究。是否GLP-1通过β-catenin改善高果糖诱导的肝脂质沉积国内外尚无报道。因此，本项研究拟通过高果糖诱导 Wistar大鼠肝脏脂质沉积并给予GLP-1干预治疗，观察脂质从头合成通路及β-catenin表达的变化，并在细胞水平应用转染技术靶向干预β-catenin表达，探讨GLP-1是否通过β-catenin改善高果糖诱导的肝脂质沉积，揭示GLP-1与β-catenin在非酒精性脂肪肝发生发展中的作用，探讨 GLP-1在肝脏脂代谢中新的生物学作用及其机制，为寻找非酒精性脂肪肝新的药物治疗提供理论基础。
　　第一部分 GLP-1受体激动剂对高果糖诱导的大鼠肝脏脂质沉积的影响
　　目的：应用高果糖饮食诱导大鼠肝脏脂质沉积，然后给予GLP-1干预，观察对该模型的一般生理、生化指标以及组织病理学的影响，从而探讨其对高果糖诱导的大鼠肝脏脂质沉积的影响。
　　方法：6周龄Wistar大鼠36只适应性喂养一周后随机分为2组：对照组（normal diet，ND）14只，高果糖组（high fructose diet，HFD）22只，对照组给予普通饲料喂养，热量组成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3%，蛋白质24.2%，总热量为348kcal/100g。高果糖组给予高果糖饲料喂养，即普通饲料中部分碳水化合物由食品级结晶果糖替代，热量组成：碳水化合物65.5%（其中果糖供能占60%），脂肪10.3%，蛋白质24.2%，总热量为348kcal/100g。各组大鼠每日等热量投喂饲料，每日记录进食量，每周测量空腹体重。8周后，从对照组及高果糖组随机抽取6只大鼠，3％戊巴比妥钠麻醉后处死，留取肝脏组织，送光镜标本，证实肝脏脂质沉积动物模型成立。然后将高果糖组随机分为2组：高果糖饮食组（HFD）8只、艾塞那肽组（high fructose diet group with Exenatid intervention，HFD+Ex）8只。艾塞那肽组给予艾塞那肽注射液10μg／kg腹部皮下注射，每日两次，对照组和高果糖组给予等体积生理盐水皮下注射。药物干预4周，每周根据新测体重值重新计算给药量。分别于高果糖喂养8周和药物干预4周末行腹腔注射葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）检测各时间点血糖值和葡萄糖曲线下面积（area under the curve, AUCglu）及清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验检测葡萄糖输注率（ glucose infusion rate，GIR），采集血清标本检测空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)。ELISA法检测血清空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）和游离脂肪酸（free fat acid，FFA）水平。采集肝脏组织标本做肝脏甘油三酯含量检测并做肝脏组织油红O染色观察大鼠肝脏脂质沉积。
　　结果：
　　1高果糖饮食诱导肝脏脂质沉积模型建立
　　1）两组大鼠一般指标比较：与 ND组比较，HFD组大鼠体重、肝指数、FBG、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、血清 TG、FFA、肝脏TG均升高，差异均有统计学意义（P<0.05)，两组大鼠血清TC、ALT、AST无统计学差异（P>0.05)。
　　2）两组大鼠糖耐量结果比较：IPGTT结果示：HFD组0 min、5 min、30 min、60 min血糖均较ND组升高（P<0.05)，差异有统计学意义。HFD组AUCglu也显著升高（P<0.05)，差异有统计学意义。
　　3）两组大鼠葡萄糖输注率比较：与ND组相比，HFD组GIR明显降低（P<0.05）。
　　4）两组大鼠肝脏组织形态学比较：肝脏油红 O染色可见 ND组大鼠肝胞浆呈淡蓝色，未见红色脂滴；HFD组大鼠肝细胞内可见大量红色脂滴，提示肝细胞脂质沉积。
　　2药物干预后，各项指标变化
　　1）三组大鼠一般指标比较：HFD组大鼠体重、肝指数、FBG、FINS、ALT、TG、FFA以及肝脏TG均明显高于ND组(P<0.05)，艾塞那肽干预后HFD+Ex组较HFD组明显降低(P<0.05)，差异有统计学意义。三组TC、AST无统计学差异（P>0.05)。
　　2）三组大鼠糖耐量结果比较：IPGTT结果示：HFD组0 min、5 min、30 min、60 min、120 min血糖均较ND组升高（P<0.05)，艾塞那肽干预后HFD+Ex组0 min、30 min、60 min、120 min血糖较HFD组下降（P<0.05)，差异均有统计学意义。HFD组大鼠AUCglu高于ND组（P<0.05），经艾塞那肽治疗后HFD+Ex组AUCglu较HFD组显著降低（P<0.05），差异均有统计学意义。
　　3）三组大鼠葡萄糖输注率比较：HFD组 GIR较 ND组明显降低（P<0.05），艾塞那肽干预后HFD+Ex组GIR较HFD组升高（P<0.05），差异有统计学意义。
　　4）三组大鼠肝脏组织形态学比较：肝脏油红 O染色可见 ND组大鼠肝胞浆呈淡蓝色，未见红色脂滴；HFD组大鼠肝细胞内可见大量红色脂滴，经艾塞那肽治疗后HFD+Ex组红色脂滴减少。
　　结论：
　　1高果糖饮食可以诱导大鼠肝脏脂质沉积，并出现高脂血症、胰岛素抵抗。
　　2 GLP-1受体激动剂可以改善高果糖饮食引起的肝脏脂质沉积，并可以降低体重和血脂，改善糖耐量和胰岛素抵抗。
　　第二部分 GLP-1受体激动剂对肝脂代谢通路中脂质从头合成途径的影响
　　目的：通过检测GLP-1受体激动剂对于脂质从头合成途径中关键酶：乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、硬脂酰CoA脱饱和酶-1（stearoyl-CoA desaturase-1， SCD-1）以及上游转录因子固醇调节元件结合蛋白-1(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1，SREBP-1)的基因和蛋白表达的影响，从脂代谢通路的角度探讨GLP-1受体激动剂改善高果糖诱导的肝脏脂沉积的直接作用及其分子机制。
　　方法：动物分组及标本采集同第一部分。采用实时荧光定量PCR技术检测ACC、FAS、SCD-1以及SREBP-1的mRNA水平，采用Western blot技术检测ACC、FAS、SCD-1以及SREBP-1的蛋白表达。
　　结果：
　　1三组大鼠脂质合成关键酶ACC、FAS和SCD-1的表达。与ND组相比，HFD组大鼠肝脏组织中ACC、FAS和SCD-1的mRNA及蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05)；与HFD组相比，艾塞那肽干预后HFD+Ex组ACC、FAS和SCD-1的mRNA和蛋白表达减低（P<0.05)。
　　2三组大鼠脂质合成上游转录因子SREBP-1的表达。与ND组相比，HFD组大鼠肝脏组织中SREBP-1的mRNA和蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05)；与HFD组相比，艾塞那肽干预后HFD+Ex组SREBP-1的mRNA和蛋白表达减低（P<0.05)。
　　结论：
　　1高果糖饮食可诱导大鼠肝脏脂质从头合成途径的关键酶ACC、FAS和SCD-1及其上游转录因子SREBP-1的基因和蛋白表达，表明高果糖饮食可以促进脂质从头合成。
　　2 GLP-1受体激动剂能降低脂质从头合成途径中关键酶ACC、FAS和SCD-1及其上游转录因子SREBP-1的基因和蛋白表达，提示GLP-1受体激动剂可能通过抑制脂质从头合成改善肝脏脂质沉积。
　　第三部分 GLP-1受体激动剂对β-catenin基因和蛋白表达的影响
　　目的：通过检测GLP-1受体激动剂干预后β-catenin基因及蛋白表达的变化以及免疫组化观测其核转位，首先明确是否β-catenin作为下游靶点参与了GLP-1受体激动剂改善脂质沉积的过程。
　　方法：动物分组及标本采集同第一部分。采用实时荧光定量PCR技术检测β-catenin的mRNA表达，采用Western blot技术检测β-catenin以及细胞核内β-catenin的蛋白表达。免疫组化观察β-catenin核转位。
　　结果：
　　1三组大鼠β-catenin的mRNA表达比较：与ND组相比，HFD组大鼠肝脏组织中β-catenin的mRNA表达减低，差异有统计学意义（P<0.05)；与HFD组相比，艾塞那肽干预后HFD+Ex组β-catenin的mRNA表达升高（P<0.05)。
　　2三组大鼠β-catenin的蛋白表达比较：与ND组相比，HFD组大鼠肝脏组织中β-catenin的蛋白表达减低，差异有统计学意义（P<0.05)；与HFD组相比，艾塞那肽干预后 HFD+Ex组β-catenin的蛋白表达升高（P<0.05)。
　　3三组大鼠细胞核内β-catenin的蛋白表达比较：与ND组相比，HFD组大鼠肝脏组织中细胞核内β-catenin的蛋白表达减低，差异有统计学意义（P<0.05)；与 HFD组相比，艾塞那肽干预后 HFD+Ex组细胞核内β-catenin的蛋白表达升高（P<0.05)。
　　4三组大鼠β-catenin的免疫组化：与HFD组相比，艾塞那肽干预后HFD+Ex组核内β-catenin着色增多，提示肝细胞中的β-catenin核转位。
　　结论：
　　1高果糖饮食诱导肝脏脂质沉积伴随肝脏β-catenin的基因和蛋白表达减低以及细胞核内β-catenin蛋白表达减低。
　　2 GLP-1受体激动剂可以上调β-catenin的基因和蛋白表达以及细胞核内β-catenin的蛋白表达。可能GLP-1受体激动剂诱导了β-catenin的表达及核转位。
　　3 GLP-1受体激动剂可能通过激活β-catenin改善肝脏脂质沉积。
　　第四部分通过调节β-catenin的表达探讨GLP-1受体激动剂改善高果糖诱导的肝细胞脂质沉积的作用机制
　　目的：应用转染技术靶向干预β-catenin的表达，观察HepG2细胞脂质沉积和脂质从头合成通路的变化，探讨GLP-1受体激动剂是否通过β-catenin调控脂质从头合成通路改善脂质沉积，揭示GLP-1与β-catenin在脂质合成过程中内在关系。
　　方法：
　　1在果糖联合Exendin-4培养的HepG2细胞中转染针对β-catenin小干扰RNA，分为以下五组：正常对照组（Con），高果糖组（HF），高果糖+Exendin-4组（ HF+Ex4），高果糖+Exendin-4+对照 RNA组（ HF+Ex4+Si-control），高果糖+Exendin-4+针对β-catenin小干扰RNA组（HF+Ex4+Si-β-catenin）。测定HepG2细胞内TG水平和油红O染色观察细胞脂质沉积情况；最后应用实时荧光定量PCR技术检测β-catenin的mRNA表达以及脂质从头合成的上游转录因子SREBP-1和下游关键酶ACC、FAS、 SCD-1的mRNA表达，采用Western blot技术检测总β-catenin、细胞核内β-catenin的蛋白表达，以及脂质从头合成的上游转录因子SREBP-1和下游关键酶ACC、FAS、 SCD-1的蛋白表达。
　　2在果糖联合Exendin-4培养的HepG2细胞中转染过表达β-catenin质粒，分为以下五组：正常对照组（Con），高果糖组（HF），高果糖+Exendin-4组（HF+Ex4），高果糖+Exendin-4+对照空质粒组（HF+Ex4+pEGFP-N1），高果糖+Exendin-4+过表达β-catenin质粒组（HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1）。所测指标同前。
　　结果：
　　1 HepG2细胞的脂质沉积体外模型建立
　　HepG2细胞培养24小时后HF组TG含量较Con组增高，差异有统计学意义（P<0.05），油红O染色HF组红染部分较Con组增多，颜色加深，表明高果糖诱导脂质沉积体外细胞模型成功建立。
　　2靶向干预β-catenin对HepG2细胞β-catenin表达的影响
　　1）在果糖联合 Exendin-4培养的 HepG2细胞中转染针对β-catenin小干扰RNA后，HF+Ex4+Si-β-catenin组β-catenin的mRNA和蛋白表达比HF+Ex4组明显降低（P<0.05），而且核内β-catenin蛋白表达也有减低（ P<0.05）。HF+ Ex4+Si-control组与 HF+ Ex4组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　2）在果糖联合 Exendin-4培养的HepG2细胞中转染过表达β-catenin质粒后HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1组β-catenin的mRNA和蛋白表达比HF+ Ex4组明显升高（P<0.05），而且核内β-catenin蛋白表达也有增加（P<0.05）。HF+Ex4+pEGFP-N1组与 HF+Ex4组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　3）在上调和下调研究中都可以发现 HF组比 Con组β-catenin的mRNA和蛋白表达以及核内β-catenin蛋白表达降低（ P<0.05），加用Exendin-4后HF+Ex4组β-catenin的mRNA和蛋白表达以及核内β-catenin蛋白表达较HF组有所升高（P<0.05）。
　　3靶向干预β-catenin对HepG2细胞脂质沉积的影响
　　1）在上调和下调研究中都可以发现 HF组比 Con组 TG水平升高（P<0.05），油红O染色红染部分增多。加用Exendin-4后HF+Ex4组TG水平较HF组下降（P<0.05），油红O染色红染部分减少。
　　2）在果糖联合 Exendin-4培养的 HepG2细胞中成功转染针对β-catenin小干扰RNA后，HF+Ex4+Si-β-catenin组TG水平比较HF+Ex4组明显增高（P<0.05），油红 O染色红染部分增多。HF+Ex4+Si-control组比较HF+Ex4组无统计学差异（P>0.05）。
　　3）在果糖联合 Exendin-4培养的HepG2细胞中成功转染针对过表达β-catenin质粒后HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1组TG水平比HF+Ex4组减低，但差异无统计学意义（P>0.05），油红 O染色红染脂滴减少。HF+Ex4+pEGFP-N1组比较HF+Ex4组TG水平无统计学差异（P>0.05）。HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1组TG水平比HF组明显减低（P<0.05），油红O染色红染脂滴明显减少。
　　4靶向干预β-catenin对HepG2细胞脂质从头合成上游转录因子和关键酶的影响
　　1）在上调和下调研究中都可以发现与Con组相比较，HF组脂质从头合成上游转录因子SREBP-1和三个关键酶ACC、FAS、SCD-1的mRNA和蛋白表达都有升高（P<0.05）。加用Exendin-4后HF+Ex4组上游转录因子 SREBP-1和三个关键酶 ACC、FAS、SCD-1的 mRNA和蛋白表达较HF组下降（P<0.05）。
　　2）在果糖联合 Exendin-4培养的 HepG2细胞中成功转染针对β-catenin小干扰RNA后，HF+Ex4+Si-β-catenin组脂质从头合成上游转录因子SREBP-1和三个关键酶ACC、FAS、SCD-1的mRNA和蛋白表达比较HF+Ex4组均明显增高（P<0.05）。HF+Ex4+Si-control组与HF+Ex4组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　3）在果糖联合 Exendin-4培养的 HepG2细胞中成功转染过表达β-catenin质粒后HF+Ex4+pEGFP-N1-hCTNNB1组脂质从头合成上游转录因子SREBP-1和关键酶ACC、SCD-1的mRNA和蛋白表达以及FAS的mRNA表达比HF+Ex4组减低（P<0.05），FAS的蛋白表达比HF+Ex4组减低但无统计学差异（P>0.05）。HF+Ex4+pEGFP-N1组与 HF+Ex4组比较无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1 GLP-1受体激动剂Exendin-4可以通过调控SREBP-1表达，从而调控脂质从头合成关键酶 ACC、FAS、SCD-1的表达改善高果糖诱导的HepG2细胞脂质沉积。
　　2β-catenin是GLP-1受体激动剂调控SREBP-1和关键酶ACC、FAS、SCD-1的表达、改善高果糖诱导的细胞内脂质沉积的关键分子。

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引言

第一部分GLP-1受体激动剂对高果糖诱导的大鼠肝脏脂质沉积的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分GLP-1受体激动剂对肝脂代谢通路中脂质从头合成途径的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分GLP-1受体激动剂对β-catenin基因及蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分通过调节β-catenin的表达探讨GLP-1受体激动剂改善高果糖诱导的肝细胞脂质沉积的作用机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:GLP-1受体激动剂与非酒精性脂肪性肝病

致谢

个人简历