缓激肽缓解阿霉素所致豚鼠心室肌细胞收缩力降低的细胞学机制研究

摘要

目的：阿霉素作为广谱抗肿瘤药物广泛用于急性白血病、乳腺癌等疾病的治疗。不幸的是，临床应用发现，阿霉素虽可高效作用于疾病患处，但一次大剂量给药可致心律失常，而长期应用则会诱导心肌收缩功能的异常而致心功能衰竭，因此限制了其临床用量的增加。缓激肽是一种具有心脏保护作用的九肽物质，近期研究表明，缓激肽对心脏缺血再灌注损伤具有保护作用，但目前并无证据证明缓激肽对阿霉素所致的心功能损伤是否有保护作用。为回答此问题，本课题采用急性给药的方法，观测在有无缓激肽的情况下，阿霉素对豚鼠心室肌细胞的长度、肌小节收缩幅度、细胞内钙瞬变的影响，并观察了阿霉素对豚鼠心室肌细胞动作电位时程和 L-型钙电流的影响以发现其细胞学机制。本研究可为缓激肽类制剂能否成为阿霉素致心功能损伤的新型药物提供重要实验资料。
　　方法：⑴将豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，用Langendorff灌流装置急性分离新鲜的豚鼠左心室肌细胞。⑵将分离好的新鲜心室肌细胞置于无钙台式液中覆上Fluo-2AM钙荧光染料，黑暗中放置25~30 min。吸出部分细胞置于动缘检测系统的凹槽中，在15 V、0.5 Hz持续、恒定的电压刺激下稳定5~10 min后，分别用含有不同浓度阿霉素（0.1μM,1μM和10μM）的细胞外液灌流心室肌细胞，观察并比较有无缓激肽（1μM）的条件下心室肌细胞肌小节收缩幅度以及细胞内钙瞬变的变化，记录肌小节的长度、心室肌细胞的收缩及舒张速率、细胞内收缩期和舒张期的钙离子浓度变化及钙瞬变幅度的变化。⑶将分离好的新鲜心室肌细胞逐级复钙至终浓度1.8 mM，在细胞外液中恒定灌流3~5 min，在电流钳模式下，对细胞给予1400 pA电流的阈上刺激，刺激频率为1 Hz,持续3 ms，引出动作电位。待图像稳定后，先后给予缓激肽以及不同浓度的阿霉素，观测心室肌细胞动作电位时程的改变。进而在电压钳模式下，观察并比较有无缓激肽时，阿霉素对心室肌细胞的L-型钙电流幅度、激活及失活曲线的影响。⑷实验数据均以均数±标准差（mean± S.D）表示，给药前后采用配对t检验，组间比较采用组间t检验，P<0.05为显著性差异， P<0.01为有极显著性差异。
　　结果：①缓激肽对阿霉素致豚鼠心室肌细胞肌小节长度及收缩舒张幅度改变的影响。和给药前相比，阿霉素可浓度依赖性地缩短心室肌细胞肌小节长度（P<0.01）。通过对比给药前后心室肌细胞的收缩和舒张速率，我们发现心室肌细胞最大收缩速率随着阿霉素浓度的升高而降低（P<0.01），心室肌细胞最大舒张速率未见明显改变。而在细胞外液中预先加入缓激肽1μM，对阿霉素所致的心室肌细胞肌小节缩短以及收缩速率降低有明显的对抗作用；②缓激肽对阿霉素所致细胞内钙离子浓度变化及钙瞬变的影响。将心室肌细胞用Fluo-2AM负载后继续采用无钙台式液灌流，观察在有无缓激肽时，阿霉素对收缩期、舒张期心室肌细胞钙离子浓度及钙瞬变幅值的变化。结果发现，阿霉素0.1μM,1μM和10μM对心室肌细胞收缩期钙离子浓度无明显影响，而舒张期细胞内的钙离子浓度呈浓度依赖性的升高（P<0.05和P<0.01），钙瞬变幅度降低（P<0.01）。预先用缓激肽孵育，可缓解阿霉素所致的心室肌细胞舒张期钙离子浓度升高和钙瞬变幅度降低现象（P<0.05和P<0.01）；③缓激肽对阿霉素所致细胞动作电位时程变化的影响。对豚鼠心室肌细胞动作电位影响的试验结果表明，阿霉素可以浓度依赖性的缩短动作电位时程（APD50和 APD90，P<0.01）。预先用缓激肽处理心室肌细胞可明显缓解阿霉素所致的APD50和APD90缩短（P均<0.01）；④缓激肽对阿霉素所致细胞L-型钙电流变化的影响。对 L-型钙电流的测定结果表明，在电压钳模式下，将心室肌细胞钳制在-40 mV，并去极化至0 mV时，观察缓激肽预处理对阿霉素致L-型钙电流峰值幅度降低的影响。结果表明，随着阿霉素浓度的增加，L-型钙电流峰值幅度呈浓度依赖性降低（P<0.01）。采用10μM的阿霉素继续观察其对L-型钙电流I-V曲线、激活及失活曲线的影响。结果表明，10μM阿霉素对L-型钙电流具有电压依赖性抑制作用，在-10 mV~+10 mV抑制作用最为明显（P<0.01），而在-40mV~-20 mV和+40mV~+60mV区间未见明显影响。通过观察心室肌细胞的激活失活曲线，我们发现高浓度的阿霉素可以减慢 L-型钙电流的激活过程，但对失活过程无明显影响。缓激肽可以有效延缓阿霉素减小 L-型钙电流的现象，且可使减慢激活的现象得到改善。
　　结论：⑴阿霉素可浓度依赖性的缩短豚鼠心室肌细胞肌小节长度、增大细胞内舒张期的钙离子浓度、减小钙瞬变幅度并缩短动作电位时程，减慢 L-型钙电流的激活而对 L-型钙电流具有抑制作用。提示阿霉素对心室肌细胞的急性毒性作用和细胞内钙离子浓度调控紊乱有关。⑵缓激肽对阿霉素所致的心室肌细胞肌小节长度和动作电位时程缩短、舒张期钙离子浓度增加、钙瞬变幅度减小以及L-型钙电流抑制均有明显的对抗作用。提示缓激肽对阿霉素引起的心功能损伤有一定的保护作用，这和其可抑制阿霉素所致的细胞内钙紊乱有关。

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引言

第一部分缓激肽和阿霉素对豚鼠心肌细胞收缩力和细胞内钙瞬变的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分缓激肽和阿霉素对豚鼠心肌细胞动作电位及L-型钙电流的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:阿霉素的心肌毒性机制研究进展

致谢

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