纯钛种植体表面生物矿化构建及对骨结合影响的研究

摘要

第一部分纯钛表面生物矿化处理工艺
　　目的：纯钛种植体表面形貌是影响种植体骨结合的重要因素之一，生物活性羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）涂层技术结合了金属材料和HA的优点，具有优良的机械力学性能和生物活性，是常用的种植体表面处理方法。生物矿化是在生物体的严格控制下，从周围环境中有选择地吸收各种元素用于构建生物体内具有特殊功能的高度有序无机晶体结构—矿物质的过程。生物矿化的体外模拟采用模拟体液（Simulation body fluid， SBF）等矿化液，模仿生物体内的结晶环境，以沉积无机矿物质。SBF具有和人体血浆相似的离子浓度，在SBF环境中沉积的HA与人体骨无机质成分、结构相似，有较好的生物活性。富自体浓缩生长因子（Concentrated Growth Factors，CGF）纤维蛋白液为血液提取物，离子浓度与血浆相近，且富含与骨修复再生密切相关的纤维蛋白和多种高浓度生长因子，可使生物矿化过程更接近体内环境。本部分研究采用喷砂-酸蚀（Sand Blast and Acid Etching，SLA）处理技术对钛表面进行预处理，分别使用SBF和CGF纤维蛋白液进行生物矿化处理，制备出具有生物活性的矿化表面，通过扫描电镜及X射线能谱仪观察表面微形貌、测定微量元素组成。
　　方法：
　　1配置矿化液：按照Kokubo的模拟体液配方配制矿化液。
　　2制备CGF纤维蛋白液：抽取beagle犬静脉血9ml，Medifuge离心机离心，分离上层清亮液体，置于一次性密封塑料试管内。
　　3钛片分组及制备
　　纯钛片：圆形，直径8mm，厚度1mm，粗糙度0.172μm。分为8组，每组3片：
　　A组：机械加工组；B组：喷砂酸蚀组；C组：SBF7天组，即机械加工的纯钛片置于SBF中，浸泡7天；D组：喷砂酸蚀+SBF7天组，即喷砂酸蚀的纯钛片置于SBF中，浸泡7天；E组：SBF14天组，即机械加工的纯钛片置于SBF中，浸泡14天；F组：喷砂酸蚀+SBF14天组，即喷砂酸蚀的纯钛片置于SBF中，浸泡14天；G组：CGF组，即机械加工的纯钛片置于CGF中，浸泡7天；H组：喷砂酸蚀+CGF组，即喷砂酸蚀的纯钛片置于CGF中，浸泡7天
　　4样品表面形貌、元素分析、表面微孔微球分布及粗糙度
　　使用 SEM-EDS观察钛片表面形貌，分析表面微量元素；使用 Nano Measure1.2测量表面孔径、粒径；使用粗糙度测试仪测量表面粗糙度。
　　结果：1钛片表面SEM形貌：A组：镜下见机械打磨划痕排列整齐。B组：低倍镜下可见钛片表面呈蜂窝状结构；高倍镜下见钛片表面为网状多级孔洞结构，孔径约0.2-4μm。C组：镜下见机械打磨划痕方向一致，未见明显矿化沉积物存在。D组：低倍镜下见钛片表面呈蜂窝状结构，可见少量矿化结节；高倍镜下钛片表面见矿化结节不规则，粒径约0.3-5μm。E组：低倍镜下可见方向一致的划痕，可见少量矿化结节；高倍镜下见矿化沉积物呈不规则片状，粒径约0.2-3μm。F组：低倍镜下可见钛片表面大面积球状沉积物覆盖；高倍镜下见沉积物呈分散性好的多孔球状，球径约1-3μm，球体表面见细小针状纳米粒子，形成发达的多孔孔隙结构。G组：低倍镜下可见方向一致的划痕，表面见少量矿化结节；高倍镜下见，矿化沉积物呈不规则高密度团块状，粒径约0.2-4μm。H组：低倍镜下见钛片呈现蜂窝状结构，可见少量矿化结节；高倍镜下见矿化结节呈不规则团块状，粒径约0.3-5μm；2 EDS分析结果：A、B、C组表面元素均为Ti；D、E、F、G、H组：表面元素均为C、O、P、Ca、Ti，其中Ca的原子百分比分别为3.41％、4.62%、9.73%、6.28%、6.81%，P的原子百分比分别为2.33%、2.82%、6.24%、4.12%、4.97%，Ca/P比分别为1.46、1.64、1.56、1.52、1.37；3 Nano Measure1.2测量结果：B组钛片表面微孔孔径：平均孔径1.28μm，0.5-3μm微孔所占比例为81%；D组、E组、G组、H组：表面矿化沉积物平均粒径分别为1.55μm、0.98μm、1.68μm、2.42μm；F组：表面微球平均粒径1.19μm；微球表面纳米粒子平均长度210nm，宽度40nm，形成平均孔径110nm的多孔孔隙结构；4表面粗糙度测量结果：B组＞A组，差异具有统计学意义（P<0.05）；A组、C组、E组、G组相比，E组＞G组＞A组，差异有统计学意义（P<0.05）；C组＞A组，差异无统计学意义；B组、D组、F组、H组相比，F组＞D组＞B组，差异有统计学意义（P<0.05），F组＞H组，差异无统计学意义。
　　第二部分纯钛表面生物矿化处理对前成骨细胞增殖分化的影响
　　目的：成骨细胞在种植体表面的黏附、增殖和分化是骨结合形成的关键。通过机械、化学、生物等表面改性技术可有效改善材料与细胞的相容性，从而影响成骨细胞的生物学行为。从仿生学角度来讲，微纳米级的HA可显著增加成骨细胞的粘附、增殖、ALP活性和钙磷沉积，通过生物矿化手段，制备具有微纳米复合形貌的钛表面可能更有利于细胞的功能表达。本部分实验通过直接荧光染色、MTT法、ALP活性检测评价MC3T3-E1细胞在各组钛片表面黏附、增殖和分化功能的差异，从细胞水平揭示成骨细胞在不同表面处理钛片的附着机理及功能性分化机制。
　　方法：
　　1钛片分组及制备：A组：机械加工组；B组：喷砂酸蚀组；C组：喷砂酸蚀+SBF7天组；D组：喷砂酸蚀+SBF14天组；E组：喷砂酸蚀+CGF组，表面处理方法同第一部分。
　　2 MC3T3-E1细胞的矿化诱导及矿化结节的鉴定
　　使用成骨诱导培养基对 MC3T3-E1细胞进行矿化诱导，硝酸银染色和茜素红染色鉴定钙结节，ALP染色评价ALP活性。
　　3采用直接荧光染色、MTT法、ALP活性检测评价MC3T3-E1细胞在各组钛片表面黏附、增殖和分化功能的差异。
　　结果：1 MC3T3-E1细胞的矿化诱导及成骨分化活性的鉴定：矿化诱导14天时茜素红染色、硝酸银染色和ALP染色结果均为阳性；2细胞在钛片表面的伸展情况：接种后48h，A组钛片表面细胞呈板状伸展铺开，细胞大而扁平呈多角形，F-actin遍布细胞质内。B组、C组、D组和E组钛片表面细胞F-actin束状相互交错，排列欠规整，细胞间突触广泛连接。其中D组钛片表面细胞伸出更多毛刺状突起和更长的伪足；3 MTT检测结果：培养1d时，OD值D组＞A组、B组和C组，E组＞A组、B组和C组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。D组＞E组，C组＞B组＞A组，但两两比较差异均没有统计学意义。培养3d、5d和7d时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；4 ALP活性检测结果：随培养时间的延长，五组ALP的比活力逐渐升高：培养4d时，D组＞B组＞A组，D组＞C组和 E组，差异均具有统计学意义（P<0.05），E组＞C组，差异没有统计学意义；培养7d和14d时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。
　　第三部分纯钛表面生物矿化处理对前成骨细胞的基因表达谱差异分析
　　目的：基因芯片是以基因序列为分析对象，以基因探针和杂交测序技术为基础的一种高效快速的核酸序列分析技术，全基因组 mRNA表达芯片可同时检测样本几乎所有已知基因的转录水平，有利于筛选出变化明显的差异基因。小鼠前成骨细胞 MC3T3-E1细胞是研究骨形成机制的经典细胞，在第二部分的研究中，我们建立了可靠且可重复的 MC3T3-E1体外诱导成骨模型，本部分实验通过全基因表达谱差异分析技术检测差异表达基因及相关的信号通路，从基因水平探讨纯钛不同表面形貌对成骨细胞骨改建的分子生物学机制。
　　方法：
　　1钛片分组及制备同第二部分。
　　2 TRIZOL法提取总RNA：于MC3T3-E1细胞矿化诱导培养后7d、14d两个时间点收集钛片表面细胞，提取总 RNA，并测定其浓度、纯度和完整性。
　　3全基因组mRNA表达谱芯片的制备。
　　4基因芯片的扫描和数据分析
　　使用Transcriptome Analysis Console_3_0软件扫描分析数据，筛选出上调或下调两倍以上的基因，使用Pathway分析筛选差异基因及相关的信号转导通路。
　　结果：1总RNA纯度、完整性检测：各组样本RNA纯度、浓度和完整性均符合实验要求；2表达谱芯片检测分析结果：2.1 B组与A组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共4027个（2255个上调，1772个下调）；14天时，2倍以上差异基因共2934个（1599个上调，1335个下调），在两个时间段均出现Tgfbr1基因的上调；2.2 C组与A组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共4087个（2202个上调，1885个下调）；14天时，2倍以上差异基因共3135个（1956个上调，1179个下调），在两个时间段均出现上调的基因有：Araf、Sipa1、Map2k7、Rasa3、Thbs1、Apc和Lrp1；2.3 D组与A组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共4540个（2550个上调，1990个下调）；14天时，2倍以上差异基因共3043个（1745个上调，1298个下调），Bmp4明显上调。在两个时间段均出现上调的基因有：Prkcd、Sipa1和Ski；2.4 E组与A组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共4073个（2416个上调，1657个下调）；14天时，2倍以上差异基因共筛选出3535个（2448个上调，1087个下调），Runx2基因明显上调。在两个时间段均出现上调的基因有Smad3和Sipa1；2.5 D组与C组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共912个（461个上调，451个下调）；14天时，2倍以上差异基因共668个（332个上调，336个下调），在两个时间段均出现上调的基因有：Bmp4和Foxh1；2.6 E组与C组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共2127个（1277个上调，850个下调）；14天时，2倍以上差异基因共387个（285个上调，102个下调），两个时间段与成骨相关的基因未见重叠。调整差异倍数为1.5倍时，两个时间段均出现上调的成骨相关基因有Jun和Inhba；2.7 D组与E组相比，矿化诱导7天时，2倍以上差异基因共1487个（716个上调，771个下调）；14天时，2倍以上差异基因共826个（329个上调，497个下调），在两个时间段均出现Bmp4的上调；3差异基因Pathway分析：差异基因主要涉及了20条途径，其中与成骨分化关系密切的有Wnt信号通路、MAPK信号通路和TGF-β信号通路。
　　第四部分纯钛种植体表面生物矿化处理对骨结合的影响
　　目的：种植体表面生物矿化处理可以改变种植体与骨组织的结合方式，提高界面结合强度，加速骨结合进程，缩短种植修复的愈合期，具有良好的生物活性。本部分研究建立了成年beagle犬人工种植牙动物模型，采用金属-骨组织联合磨片技术观察种植体与骨组织的结合，分析评价生物矿化种植体表面促进骨结合、增加骨结合力的机制，为设计具有优良表面形貌结构的人工牙种植体、提高人工种植牙的成功率提供实验依据。
　　方法：
　　1实验动物：成年健康雄性Beagle犬15只。
　　2种植体分组及制备
　　埋置式纯钛螺纹种植体，直径3.5mm，长度8mm，分为5组，每组18枚，共90枚，种植体的表面处理方法同第二部分钛片表面处理。
　　3 Beagle犬拔牙后延期种植动物模型的建立
　　全麻下拔除Beagle犬下颌第一、二、三、四前磨牙，三个月后将90颗种植体植入beagle犬双侧下颌骨内。
　　4标本留取与处理
　　分别于术后4、8、12周处死动物，进行大体观察并拍摄X线片以观察骨愈合情况。一半标本随即进行旋出扭力测试，另一半标本固定后制备硬组织切片。
　　5组织学观察和骨计量学
　　在荧光显微镜下观察并测量计算骨矿化沉积率；硬组织切片染色后显微镜观察界面成骨情况，测量并计算骨结合指数和种植体周围骨钙化面积百分率，将所得数据进行统计学处理。
　　结果：1种植术后X线观察：术后4w、8w、12w时，X线片和CBCT观察种植体周围均未见异常透射影像，颈部垂直骨吸收均小于2mm；2双荧光标记结果：术后4w，种植体周围可见散在黄、绿色荧光，A组和B组黄色荧光主要集中在种植窝壁上、C组、D组和E组在种植体表面和周围窝壁均可见黄色荧光；术后8w，荧光显色的范围和数量较4w时明显增加，黄色荧光呈片状、绿色荧光呈线状分布，与种植体相接触，并沿种植窝壁向螺纹内部生长，C组、D组和E组螺纹凹槽底部见有部分荧光分布；术后12w，A组、B组荧光条带主要集中在周围骨创区，种植体表面较少。C组、D组和E组种植体表面和相应的骨表面均有黄色荧光条带，并有绿色条带将其连接在一起；3硬组织切片组织学观察：术后4周，种植体螺纹间充满稀疏新生编织骨，自备洞骨缘向螺纹斜面爬行生长。和A组、B组相比， C组、D组和E组种植体骨小梁量较多，排列较为致密；术后8周，种植体周围新生骨量较4周时明显增加，新生骨沿螺纹斜面爬行至螺纹底部，新生骨小梁骨髓腔变小；术后12周，新生骨排列致密有序，形成板层结构， A组和B组种植体-骨的接触主要集中在种植体螺纹顶端和斜壁，C组、D组和E组种植体-骨的接触主要集中在螺纹底部凹槽，接触成骨现象更加明显；4统计学处理结果：4.1种植体旋出扭力峰值，术后4w时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）；术后8w时，扭力峰值D组＞E组＞C组＞B组＞A组，B组＞A组，D组＞E组＞C组，除C组＞B组差异无统计学意义外，其余各组差异具有统计学意义（P<0.05）；术后12w时，扭力峰值D组＞C组＞B组＞A组，差异具有统计学意义（P<0.05），D组＞E组，E组＞C组，但差异没有统计学意义；4.2矿化沉积率（MAR）4w、12w时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）；术后8w时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，E组和C组间差异无统计学意义，其余各组两两比较均有统计学意义（P<0.05）；4.3骨结合指数(OI%)：术后4w和8w时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）；术后12w时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，除E组和C组间差异无统计学意义外，其余各组两两比较均有统计学意义（ P<0.05）；4.4种植体周围骨钙化面积百分率（CA%)：术后4w时，D组＞E组＞C组＞B组＞A组，除E组和C组间差异无统计学意义外，其余各组两两比较均有统计学意义（P<0.05）；术后8w和12w时， D组＞E组＞C组＞B组＞A组，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1纯钛表面不同基础处理对生物矿化效果有影响，经喷砂酸蚀表面基础处理可获得微纳米多级孔洞结构，有利于生物矿化形成。
　　2矿化时间对矿化效果有影响，SBF2周矿化处理矿化质量优于1周矿化处理。
　　3 CGF纤维蛋白液矿化处理效果优于SBF生物矿化液。
　　4小鼠前成骨细胞 MC3T3-E1体外矿化诱导14天即可出现矿化成骨，是体外研究生物材料对细胞黏附、增殖功能影响的可靠细胞。
　　5纯钛表面处理形成不同的形貌结构，可影响 MC3T3-E1细胞的黏附伸展、增殖和分化。
　　6纯钛表面经CGF纤维蛋白液、SBF矿化处理有利于MC3T3-E1细胞的黏附伸展、增殖和分化。
　　7纯钛表面不同处理可导致 MC3T3-E1细胞基因表达差异，通过基因表达差异分析可推断不同表面处理通过不同的信号通路影响细胞的黏附、增殖、分化和成骨。
　　8喷砂酸蚀处理可上调Tgfbr1基因，推测其促进MC3T3-E1细胞成骨分化可能与TGF-β信号通路有关。
　　9 SBF生物矿化处理可上调Map2k7、Bmp4基因，推测SBF生物矿化可能通过Wnt、MAPK和TGF-β信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化。
　　10 CGF生物矿化处理可上调Runx2、Smad3基因，推测CGF生物矿
　　化可能通过MAPK、TGF-β信号通路促进MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化。
　　11纯钛种植体表面经不同方法处理形成不同的形貌结构，对种植体骨结合形成方式有影响。
　　12单纯机械加工种植体的骨结合形成方式主要为距离成骨；经喷砂酸蚀处理纯钛种植体表面有部分接触成骨；生物矿化处理纯钛种植体表面的成骨方式均为双向成骨。
　　13 SBF矿化处理2周种植体新骨形成量最多，CGF矿化处理1周次之，SBF矿化处理1周、喷砂酸蚀处理、机械加工处理纯钛种植体新骨形成量依次减少。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

引言

第一部分纯钛表面生物矿化处理工艺

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分纯钛表面生物矿化处理对前成骨细胞增殖分化的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分纯钛表面生物矿化处理对前成骨细胞的基因表达谱差异分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分纯钛种植体表面生物矿化处理对骨结合的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:纯钛种植体表面生物矿化处理的研究进展

综述二:纯钛种植体表面不同处理对骨结合的影响

致谢

个人简历