大鼠视神经损伤后色素上皮衍生因子对视网膜神经节细胞及caspase-3表达的影响

摘要

目的：随着人类科技的日趋进步、交通工具的更新换代，在眼科疾病中外伤性视神经损伤所占的比例越来越大。目前临床上对于视神经损伤的治疗普遍给予药物治疗若有手术适应症则进行视神经管减压术，但是大多数患者在治疗后效果不尽人意，对于目前视神经损伤的病情控制和干预，至今还没有特效的药物或方法。很明显,现在有必要提出新的策略来减少退化的神经元数量和保护幸存的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs），在对视力造成损害的视神经疾病中,包括青光眼在内,影响着世界上超过6500万人,是一个不可逆的致盲原因。视网膜神经节细胞及其轴突的变性是造成患者实力损害的罪魁祸首。如何减少视神经损伤的并发症、降低该病的致盲率，成为我们目前面临的最大挑战。有动物实验研究表明，色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor, PEDF）就有强大的神经保护作用。在此次研究中，通过建立大鼠视神经损伤的动物实验模型，向玻璃体内定期间断注射PEDF，观察并探索PEDF对视神经的保护机制。
　　方法：共有90只 SD大鼠纳入本次实验（由河北医科大学实验动物中心提供），且均为雌性，体重200-250g，眼部检查无异常，适应性喂养1周,随机分为：空白对照组、模型对照组和实验组，每组各30只。各组之间的大鼠体重均无统计学差异。在此次试验中，每组大鼠的左眼为实验用眼，右眼处于自然状态。
　　除空白对照组大鼠之外其它两组大鼠在模型制作之前12小时进行禁食，然后按体重向大鼠腹腔内注射10％水合氯醛（0.35ml/100g），用手术器械将切口周围软组织分离，使得眶内段视神经得以暴露，采用中号显微血管夹钳夹视神经，在眼眶内球后2mm处，持续钳夹时间为20s，视神经损伤后用8-0可吸收缝线缝合球结膜2针。用无菌的蒸馏水将 PEDF溶解，并且以玻璃体给药的方式将浓度为0.2μg/μl共5μl的药液注射进实验组大鼠的玻璃体腔，第一次玻璃体给药在视神经损伤模型制作成功后的第0天，并且，在视神经损伤后的第7天、第14天以相同的剂量和浓度各重复给药一次。模型造模成功后向患眼玻璃体内注射平衡盐溶液5μl，模型对照组第一次玻璃体给缓冲液是在模型制作后的第0天，并且，在视神经损伤后的第7天、第14天以相同的剂量和浓度各重复给药一次。每次给药后结膜囊内涂抗生素眼膏进行局部抗炎
　　3组大鼠均在第21天时10%水合氯醛（0.35ml/100g）麻醉，随机在空白对照组的大鼠中取20只左侧眼球（20只眼），分别在模型对照组和实验组的大鼠中各取20只左侧眼球（20只眼）,检查各组大鼠左侧实验眼均未发生白内障，并且确定晶状体在造模的手术中和重复性玻璃体注射中未受到损伤。用眼科器械将摘下的大鼠眼球剪开，在显微镜下轻柔地将眼球清理干净。用4%的甲醛液给予标本固定，将制作好的标本放置于4℃冰箱，等眼球组织固定好后进行脱水、透明、石蜡包埋、切片，厚度大约为6μm，在光学显微镜下观察制作的标本，与此同时完成标本的图像采集工作。
　　对之前做好待用的切片进行HE染色，观察视网膜各层细胞在光镜下的一系列变化，同时对RGCs进行计数，使用图像分析系统(×400)对制备好的标本切片进行分析(每张组织标本切片取4个光学显微镜下的视野，以视盘为圆心，以1.5mm为半径形成处的圆形范围内，四个方向对称的各取1个视野，每只眼球只抽取和使用1张切片)。我们同时对一部分待用的切片进行免疫组织化学染色，检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）在大鼠视网膜的表达情况，通过计算机对观察得到的结果进行分析，用多功能真彩色细胞图像分析管理系统对视网膜中caspase-3阳性反应部位进行分析，测得平均光密度值（AOD）。抗原表达量以免疫染色阳性的AOD来表示，若AOD的数值越大则表示视网膜中caspase-3阳性表达越强。
　　随机在空白对照组取10只大鼠左侧眼球（10只眼），模型对照组和实验组分别取10只大鼠左眼（10只眼）眼球制作标本，对制作的标本进行电镜观察和对比。
　　实验数据用(-X)±S（均数±标准差）表示，不同组间数据进行两样本 t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。
　　结果：
　　1、RGCs在光镜下的形态学变化
　　空白对照组：切片组织的最内侧为视网膜神经节细胞层，最外侧为感光细胞层，两细胞层之间是双极细胞层。视网膜神经节细胞的表现特点：细胞排列呈现出单层、密集、整齐的形态特点，神经节细胞胞核清楚易分辨；在视网膜神经节细胞层以外的细胞层也都有各自的表现特点:它们排列为多层性，并且每一层细胞在排列时细胞与细胞之间的间隙很小。模型对照组：视网膜神经节细胞层的神经节细胞表现出明显的稀疏、紊乱，大量视网膜神经节细胞有核碎裂、染色质边聚、空泡变性等现象出现,其他两细胞层也在不同程度上出现细胞减少现象。实验组：该组中视网膜神经节细胞之间的排列情况稍好些，主要表现为比模型对照组中细胞的排列紧密。
　　2、光镜下RGCs计数
　　各组RGCs计数结果：空白对照组、模型对照组、实验组三组的实验结果数据分别为（29.53±2.05）、（8.5±1.59）、（14.03±1.66），三组实验组结果进行两两比较，其比较结果为三组视网膜神经节细胞计数结果两两比较差异均有显著统计学意义（P<0.01）。
　　3、RGCs的超微变化
　　空白对照组：该实验中大鼠的视网膜神经节细胞的细胞核呈现出卵圆形、核大,核质均匀等的特点,在电镜下能够观察到细胞核内的线粒体、高尔基体、核糖体、粗面内质网等一系列的超微组织结构。另外,还可以见到一些细胞凋亡的具体证据如：神经节细胞染色加深、浓缩,细胞胞浆出现了不同程度的萎缩现象,从而使得胞浆电子密度增加，电子致密物在核膜下边集，电子致密物聚集不均匀，但细胞的胞膜和核膜尚且保留完全。在电子显微镜下观察模型对照组的视网膜神经节细胞，其中线粒体、高尔基体、核糖体、粗面内质网等一些超显微结构均能被发现，然而，电镜下模型对照组与空白对照组的表现进行比较，可见模型对照组电镜下核糖体、高尔基体、粗面内质网在数量上有明显减少,线粒体也出现一系列的破坏现象比如嵴断裂、溶解乃至消失，与此同时还发现一部分神经节细胞当中的某些细胞器发生变性、溶解甚至数量减少，胞质染色加深、浓缩,细胞胞浆也出现了萎缩的现象,电子密度增加，电子致密物在核膜下边集，电子致密物聚集不均匀，细胞的胞膜和核膜保留完全。实验组视网膜的大体形态和组织结构层次清晰,细胞膜和核膜结构未见明显异常或损坏,视网膜节细胞核的大体形态也基本正常,其细胞胞质内的细胞器虽有不同程度的损伤但结构还算完整而且数量损失也较小。但是也有一些不同程度的凋亡的神经节细胞残留。
　　4、caspase-3在视网膜的表达
　　空白对照组未见明显着染细胞；实验组中的神经节细胞被着色的细胞个数少并且着色较浅；而模型对照组的神经节细胞在数量上被着色的较多且着染较深。空白对照组、实验组和模型对照组三组大鼠的视网膜caspase-3表达情况分别为：微弱、较弱、显著。空白对照组、实验组、模型对照组各组的视网膜内测得的 caspase-3的平均光密度值分别为（0.0976±0.0168）、（0.1523±0.0085）、（0.2053±0.0184），且三组平均光密度值结果进行两两比较，其比较结果显示三组实验结果两两之间均具有显著统计学意义（P<0.01）。
　　结论：
　　1、PEDF支持视神经损伤后RGCs的存活和恢复。
　　2、视神经损伤后PEDF能够通过减少视网膜caspase-3的表达，抑制凋亡级联反应的进行，进而对RGCs起到保护作用。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 试验方法

结果

1 大鼠视网膜 HE 染色结果

2 视网膜神经节细胞数量变化

3视网膜caspase-3免疫组织化学结果及半定量检测

4 电镜下RGCs的超微结构变化

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:PEDF对外伤性视神经损伤修复作用的探讨

致谢

个人简历

一、 一般情况

二、 个人经历

三、 获奖情况

四、 发表文章