膜联蛋白A11对人胃癌细胞株SGC7901 5-Fu耐药性影响及机制的研究

摘要

目的：近年来，虽然全球范围内的胃癌发病率处于下降趋势，但我国的胃癌发病率却在逐年上升。胃癌的发病率与死亡率均仅次于肺癌，位于第二位。以手术为主的综合治疗是目前胃癌的主要治疗手段，但我国早期胃癌的诊断率不足10％，大多数患者就诊时往往失去了根治性手术的机会，这就使化疗在胃癌的综合治疗中占据重要的地位。自5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）问世以来，已过去50多年，但其仍是当前胃癌化疗方案的重要组成。由于肿瘤细胞对此类药物原发性和继发性耐药，导致其单药化疗有效率不到20%。因此，阐明5-Fu的耐药机制，缓解甚至逆转其耐药，成为当今亟待解决的问题。膜联蛋白家族（Annexins）是广泛表达于除酵母之外的真核细胞的细胞质及细胞核膜上的钙调节磷脂结合蛋白，其通过调节细胞膜表面蛋白与其他位于细胞内、细胞核膜、细胞外基质的蛋白之间相互作用而发挥功效。膜联蛋白家族共有A、B、C、D、E五个组，A组发现于哺乳动物，包括12个成员（A1-A11和A13）。目前研究表明膜联蛋白A11(Annexin A11, ANXA11)与肿瘤的发生及发展有着密切关系。既往在胃癌中研究发现膜联蛋白A11在胃癌组织中的阳性表达率和表达强度较正常胃组织中明显增高。ANXA11在转移的淋巴结中的阳性表达率和表达强度也较胃癌原发灶中明显增高。可见ANXA11与胃癌的发生、发展及转移密切相关。但目前关于ANXA11在不同胃癌细胞株中的表达，及其与胃癌细胞5-Fu耐药的关系尚未报道。本研究以人胃癌细胞株SGC7901为研究对象，应用RNA干扰技术抑制SGC7901细胞中ANXA11的表达，检测不同组对5-Fu敏感性，发现转染组较阴性对照组、空白对照组敏感性提高，并对其相关机制进行初步探讨。为阐明胃癌5-Fu耐药机制进一步提供理论基础，对于缓解乃至逆转胃癌的5-Fu耐药性及新治疗靶点的发掘具有重要意义。
　　方法：培养人胃癌细胞株SGC7901、人胃癌细胞株BGC-823，应用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)检测ANXA11 mRNA及蛋白在两种细胞株中的表达，并选取ANXA11高表达的人胃癌细胞株SGC7901。设计并合成针对ANXA11的特异性干扰序列siRNA及其阴性对照序列，应用Lipofectamine2000转染试剂将ANXA11-siRNA及阴性对照序列瞬时转染入SGC7901细胞，转染后24h、48h、72h应用qPCR检测ANXA11 mRNA的表达，应用Western Blot检测蛋白的表达情况，检测干扰效果。应用CCK-8法检测转染后各组细胞对5-Fu的药物敏感性改变并计算出各组IC50(half maximal inhibitory concentration)与IC20值（考虑IC50浓度的5-Fu对细胞杀伤力较大，遂后续实验采用IC20浓度的5-Fu作用于ANXA11-siRNA-1转染组细胞）。实验分组为：ANXA11-siRNA-1转染组（以下简称为转染组）、ANXA11-siRNA-1转染组联合IC20浓度的5-Fu组（以下简称为联合组）、阴性对照组及空白对照组。应用流式细胞术检测各组凋亡率，应用qPCR、Western Blot检测中胸腺嘧啶脱氧核苷合成酶(Thymidine synthetase, TS)、Bax和Bcl-2 mRNA及蛋白水平表达的改变。
　　结果：
　　1.ANXA11 mRNA在人胃癌细胞株SGC7901、人胃癌细胞株BGC-823细胞中的相对表达量分别为：0.045±0.0012、0.022±0.004。ANXA11蛋白在人胃癌细胞株SGC7901、人胃癌细胞株BGC-823细胞中的相对表达量分别为：1.410±0.180、0.261±0.041。ANXA11 mRNA及蛋白表达量在人胃癌细胞株SGC7901中的表达显著高于人胃癌细胞株BGC823（P=0.033, P=0.000）。
　　2.ANXA11-siRNA转染人胃癌细胞株SGC790124、48、72小时后，通过qPCR在mRNA水平检测ANXA11的抑制效果。结果发现，与阴性对照组及空白对照组相比，3条ANXA11-siRNA(ANXA11-siRNA-1、ANXA11-siRNA-2、ANXA11-siRNA-3)及3条 ANXA11-siRNA的混合（ANXA11-siRNA123）对ANXA11的表达均有不同程度的抑制作用，其中转染后48小时 ANXA11-siRNA-1的抑制效果最好（F=28.631, P=0.000）。采用不同浓度（20nM、40nM、60nM、80nM、100nM）的ANXA11-siRNA-1进行转染，24、48、72小时后，通过Western Blot在蛋白水平检测ANXA11的抑制效果。与阴性对照组及空白对照组相比，其对ANXA11的蛋白表达均有不同程度的抑制作用，其中转染后48小时40nM浓度的抑制效果最好（F=24.887, P=0.000）。
　　3.CCK-8实验中，采用1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的5-Fu作用于转染后不同组人胃癌细胞株SGC790124、48、72、96h，其中48h时转染组与阴性、空白对照组OD值有明显差异（P<0.05）。在48小时组，人胃癌细胞株SGC7901转染ANXA11-siRNA-1后对5-Fu的IC50为：6.827±0.770μg/ml，阴性对照组为：11.487±0.669μg/ml，空白对照组为12.053±0.720μg/ml。相应的IC20分别为0.086±0.011μg/ml、0.191±0.0188μg/ml、0.189±0.0153μg/ml。转染ANXA11-siRNA-1后人胃癌细胞株SGC7901对5-Fu的敏感性显著高于阴性对照组及空白对照组(F=47.500, P=0.000;F=45.523, P=0.000)。
　　4.人胃癌细胞株SGC7901转染ANXA11-siRNA-1后细胞凋亡率为（18.747±2.064）%，联合组为（30.153±2.344）%，阴性对照组为（6.657±0.976）%，空白对照组为（6.510±1.509）%。转染组、联合组凋亡率较阴性对照组及空白对照组显著升高（F=118.403, P=0.000），且联合组凋亡率较转染组凋亡率明显升高（P=0.000）。
　　5.人胃癌细胞株SGC7901转染ANXA11-siRNA-1后ANXA11蛋白的相对表达量为：0.523±0.091，联合组为0.167±0.060，阴性对照组为：0.887±0.075，空白对照组对照组为0.863±0.125。联合组及转染组蛋白表达显著降低(F=41.623, P=0.000)。联合组与转染组之间差异也具有统计学意义(P=0.001)。
　　6.应用qPCR检测转染ANXA11-siRNA-1及转染ANXA11-siRNA联合5-Fu对Bax、Bcl-2及TS mRNA表达的改变，发现与阴性对照组及空白对照组相比，转染组与联合组Bax的mRNA表达上调，而Bcl-2、TS的mRNA表达显著下调（F=35.608, P=0.000;F=30.048, P=0.000;F=22.874, P=0.000）。应用Western Blot检测上述基因蛋白表达的改变，发现与阴性对照组及空白对照组相比，转染组与联合组Bax的蛋白表达上调，而Bcl-2、TS的蛋白表达显著下调（F=24.396, P=0.000;F=33.890, P=0.000;F=29.630, P=0.000）。联合组与转染组之间差异也具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：
　　1.ANXA11在人胃癌细胞株SGC7901中表达较高。抑制ANXA11表达可提高人胃癌细胞株SGC7901的凋亡率。
　　2.抑制ANXA11表达可提高5-Fu的杀伤力，继而增加人胃癌细胞株SGC7901对5-Fu敏感性， ANXA11可能是参与人胃癌细胞株SGC79015-Fu耐药的新的基因。
　　3.抑制ANXA11表达提高人胃癌细胞株SGC79015-Fu敏感性可能与抑制TS的表达有关，同时也与下调抑凋亡基因Bcl-2、上调促凋亡基因Bax的表达从而促使细胞凋亡有关。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料与仪器

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 人胃癌细胞株SGC7901及人胃癌细胞株BGC823中ANXA11 mRNA及蛋白的表达

2 ANXA11-siRNA转染人胃癌细胞株SGC7901的效果

3 人胃癌细胞株SGC7901转染后不同组对5-Fu的敏感性变化

4 人胃癌细胞株SGC7901转染后不同组及联合组凋亡率变化

5 人胃癌细胞株SGC7901转染组及联合组ANXA11蛋白的表达

6 人胃癌细胞株SGC7901转染组及联合组Bcl-2、Bax、TS mRNA及蛋白的表达

附图

附表

讨论

1 ANXA11在肿瘤中的表达

2 ANXA11与肿瘤耐药性的关系

3 胃癌5-Fu耐药与ANXA11及TS、Bax及Bcl-2的关系

结论

参考文献

综述:氟尿嘧啶药物的发展及胃癌的耐药机制

致谢

个人简历