补肾法、疏肝法改善超促排卵小鼠子宫内膜容受性与调控MAPK家族信号通路的关系

摘要

目的：本研究通过观察补肾法、疏肝法对超促排卵小鼠围着床期子宫内膜VEGFR-2及其下游血管生成MAPK家族信号通路的影响，以探讨两种方法改善子宫内膜容受性的作用机制和环节之异同。
　　方法：将240只动情周期正常的雌性小鼠随机分为正常组、模型组、补肾组、疏肝组，每组各60只。除正常组外，各组建立控制性超促排卵小鼠模型。补肾组、疏肝组分别从造模第1天开始灌胃补肾助孕方混悬液和逍遥丸混悬液。模型组和正常组给予同等剂量蒸馏水灌胃，连续11天。正常组于动情期，模型组、补肾组、疏肝组于注射HCG日，按雌:雄=2:1比例合笼饲养。次日晨见阴栓记为孕1d，各组孕鼠分别于孕2d、3d、4d、5d、6d取材，通过放射免疫法检测小鼠血清中雌二醇（E2）、孕酮（P）含量；采用HE染色观察小鼠子宫内膜厚度及形态学变化；扫描电镜观察小鼠子宫内膜胞饮突的形态，免疫组化法检测小鼠子宫内膜雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、微血管密度（MVD）、VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白表达，Western Blot法检测小鼠子宫内膜ER、PR、PCNA、CyclinD1、MMP-9、VEGF、VEGFR-2及其下游血管生成相关分子蛋白表达，实时荧光定量PCR检测VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9mRNA表达；统计比较各组小鼠阴栓率、妊娠率及胚胎着床数。
　　结果：
　　1.各组小鼠阴栓率、妊娠率及胚胎着床数:与正常组比较，模型组小鼠阴栓率、妊娠率均下降，胚胎着床数减少，差异有统计学意义；与模型组相比，补肾组、疏肝组阴栓率、妊娠率均提高，且胚胎着床数增加；补肾组阴栓率、妊娠率及胚胎着床数较疏肝组增加，但两组比较无统计学意义。
　　2.围着床期各组小鼠雌孕激素及其受体水平比较:各组小鼠随着妊娠天数的增加，血清E2、P值逐渐升高。孕第2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组小鼠血清E2值降低，差异有统计学意义；与模型组比较，补肾组、疏肝组血清E2值升高。孕第3、5天补肾组血清E2值高于疏肝组，差异有统计学意义，其余各天两组比较无统计学差异。孕第2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组小鼠血清P值降低，差异有统计学意义；与模型组比较，补肾组、疏肝组血清P值升高；补肾组与疏肝组比较无明显统计学差异。ER、PR蛋白表达主要定位于小鼠子宫内膜腺体、间质的胞浆中。孕第2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组ER、PR蛋白表达降低；与模型组比较，补肾组、疏肝组ER、PR蛋白表达升高；补肾组与疏肝组之间比较表达无明显差异。
　　3.围着床期各组小鼠子宫内膜厚度比较:各组小鼠随着妊娠天数的增加，子宫内膜逐渐增厚。与正常组比较，模型组小鼠孕第2、3、4、5、6天子宫内膜厚度均明显降低；与模型组比较，补肾组、疏肝组孕第2、3、4、5、6天子宫内膜厚度均显著增加；补肾组与疏肝组比较，差异无统计学意义。
　　4.围着床期各组小鼠子宫内膜形态学变化。HE染色显示：正常组：小鼠随着妊娠天数的增加，子宫内膜逐渐增厚；腺体数量增多，腺腔变大、弯曲，腺腔分泌物增多；间质疏松水肿，基质细胞增大，在孕第4天后宫腔逐渐闭合，基质细胞增殖分化成蜕膜细胞。模型组：与正常组比较，子宫内膜较薄且发育不良，腺体少而小，腺腔扩张不明显，腺腔分泌物较少；间质疏松水肿，相对致密，部分小鼠子宫内膜呈现腺体与间质发育不同步，间质呈分泌期改变而腺体发育仍为增生期。补肾组、疏肝组内膜发育与正常组接近，优于模型组，两组间比较无明显差异。
　　5.围着床期各组小鼠子宫内膜胞饮突的变化。胞饮突主要分布于子宫内膜腺体开口处。正常组：孕第3天，部分子宫内膜细胞表面形成一些膜状突起，突起表面有微绒毛覆盖，绒毛短，稀疏，为发育中的胞饮突；孕第4天子宫内膜表面有大量均匀分布、边界清楚的膜状突起，表面光滑，无微绒毛覆盖，为完全发育的胞饮突；孕第5天胞饮突表面皱缩，凹陷，微绒毛重新出现，为退化的胞饮突。模型组：孕第3天，胞饮突凸起较正常组明显，微绒毛较短较稀疏，发育较正常组提前；孕第4天，子宫内膜胞饮突数量较正常组减少，表面皱缩，大小不一，整体发育不同步，未见完全发育的胞饮突，提示胞饮突发育提前；孕第5天胞饮突皱缩较正常组明显，微绒毛较少。补肾组、疏肝组：孕第3天，膜状突起出现，表面覆有微绒毛；孕第4天为完全发育的胞饮突，较模型组表面相对饱满、分布相对均匀；孕第5天胞饮突发育与正常组接近，为退化的胞饮突。
　　6.免疫组织化学法检测MVD在不同分组之间的比较:CD34为血管密度标志物，表达于子宫内膜血管内皮细胞，用于测定MVD。孕第2、3、4、5、6天：与正常组相比，模型组MVD明显下降；与模型组比较，补肾组、疏肝组MVD显著增加；与正常组比较，补肾组、疏肝组MVD降低。孕第6天，补肾组MVD高于疏肝组，差异有统计学意义。
　　7.免疫组织化学法检测VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白定位。VEGF、VEGFR-2蛋白在围着床期小鼠子宫内膜的表达在空间上高度一致，主要定位在子宫内膜腔上皮、腺上皮细胞、间质细胞及血管内皮细胞的胞浆中；PCNA蛋白表达主要定位在子宫内膜腔上皮、间质细胞核内，腺上皮细胞核有少量表达；CyclinD1主要表达于子宫内膜腔上皮、腺上皮的细胞核中，间质细胞核内表达较弱；MMP-9在子宫内膜的腔上皮、腺上皮及间质细胞浆中均有表达。
　　8.VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA时序表达规律。孕第2天VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA表达较低，之后逐渐上升，于孕第4天达到峰值，与其他时间点比较差异有统计学意义，之后表达逐渐下降。
　　9.VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白及其mRNA表达结果在不同分组之间的比较。孕第2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组小鼠子宫内膜VEGF和VEGFR-2蛋白及其mRNA表达降低，差异有统计学意义；与模型组相比，补肾组、疏肝组VEGF、VEGFR-2蛋白及其mRNA表达明显升高。但与正常组比较，孕第2、4、5、6天，补肾组、疏肝组VEGF蛋白及其mRNA表达降低，孕第3、4、5、6天补肾组、疏肝组VEGFR-2蛋白及其mRNA表达降低。孕第6天补肾组VEGF、VEGFR-2蛋白及其mRNA表达高于疏肝组，差异有统计学意义，其余各天补肾组与疏肝组比较无统计学差异。孕第2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组小鼠子宫内膜PCNA蛋白及其mRNA表达低于正常组，差异有统计学意义；与模型组相比，补肾组、疏肝组PCNA蛋白及其mRNA表达明显增多。孕第2、3、6天，补肾组与正常组比较无统计学差异，孕第4、5天补肾组低于正常组，差异有统计学意义。孕第2、3、4、5天补肾组PCNA蛋白及其mRNA表达均高于疏肝组。孕第2、3、4、5、6天：与正常组相比，模型组小鼠子宫内膜CyclinD1蛋白及其mRNA表达明显低于正常组，差异有统计学意义；与模型组相比，补肾组、疏肝组CyclinD1蛋白及其mRNA表达明显升高；补肾组、疏肝组低于正常组，两组间比较无统计学差异。孕第2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组小鼠子宫内膜MMP-9蛋白及其mRNA表达下降，差异有统计学意义；与模型组相比，补肾组、疏肝组MMP-9蛋白及其mRNA表达明显升高。孕第2、3、4、5天补肾组低于正常组，孕第2、4天疏肝组低于正常组，孕第2、3、4、5天疏肝组高于补肾组。孕第6天，补肾组、疏肝组、正常组比较无统计学差异。
　　10.Western Blot法检测VEGFR-2下游MAPK家族信号通路蛋白表达。孕2、3、4、5、6天：与正常组比较，模型组p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表达降低；与模型组比较，补肾组p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表达升高；疏肝组p-P38、p-JNK蛋白表达增强，差异有统计学意义，疏肝组p-ERK表达增强，但差异无统计学意义；疏肝组p-ERK蛋白表达较补肾组降低，差异有统计学意义。
　　结论：
　　1.VEGF参与胚泡着床且在围着床期表达具有时空特异性，可作为子宫内膜容受性评价指标。
　　2.控制性超促排卵降低围着床期小鼠血清E2、P水平，影响ER、PR表达，使子宫内膜腺体与间质发育不同步，胞饮突发育提前，下调VEGF及其受体，降低微血管密度，影响VEGFR-2下游MAPK家族3条信号通路，降低通路活性，减少磷酸化ERK、P38、JNK的表达，下调通路下游目的基因PCNA、CycinD1、MMP-9的表达，影响子宫内膜血管生成，降低子宫内膜容受性，导致妊娠率、着床率降低。
　　3.补肾法、疏肝法通过改善超促排卵小鼠血清E2、P水平及ER、PR表达，改善子宫内膜形态及胞饮突发育，上调VEGF及其受体，改善微血管密度，调控VEGFR-2下游MAPK家族3条信号通路，增加通路活性，提高磷酸化ERK、P38、JNK的表达，促进通路下游目的基因PCNA、CycinD1、MMP-9的表达，促进细胞增殖迁移，有利于子宫内膜血管生成，改善子宫内膜容受性，从而提高小鼠妊娠率和着床率。
　　4.补肾法促进磷酸化ERK表达优于疏肝法；补肾法在促进内皮细胞增殖，加速血管生成，改善子宫内膜容受性方面优于疏肝法；疏肝法在水解细胞外基质(ECM)，促进细胞迁移，促进血管生成，改善子宫内膜容受性方面优于补肾法。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1.实验材料

2 分组与给药

3 取材

4 检测指标及方法

5 统计学方法

结果

2 围着床期各组小鼠雌孕激素及其受体水平比较

3 围着床期各组小鼠子宫内膜厚度比较

4 围着床期各组小鼠子宫内膜形态学变化

5 围着床期各组小鼠子宫内膜胞饮突的变化

6 免疫组织化学法检测ER、PR、MVD、VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9蛋白定位及表达

7 实时荧光定量PCR法检测子宫内膜组织VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9mRNA表达

8 Western Blot 法检测VEGF、VEGFR-2、PCNA、CyclinD1、MMP-9 蛋白表达

9 Western Blot法检测VEGFR-2下游MAPK家族信号通路蛋白表达

附图

附表

讨论

1 控制性超促排卵动物模型的选择

2 COH周期降低子宫内膜容受性的机制探讨

3 补肾法、疏肝法立法及组方依据

4 补肾法、疏肝法改善子宫内膜容受性机制的研究

结论

参考文献

综述:中医药改善子宫内膜容受性机制的研究

致谢

个人简历