细胞骨架integrinβ1和nesprin-2在盆腔器官脱垂中的意义

摘要

目的：
　　1研究盆腔器官脱垂患者（pop）和对照者骶韧带组织中integrinβ1和nesprin-2的表达及意义；
　　2机械力对骶韧带原代培养的成纤维细胞中integrinβ1和nesprin-2的影响；
　　3研究其在pop的发病机制中的作用。
　　方法：
　　1研究对象:选取2016年3月一2016年9月在河北医科大学第二医院东院区妇产科接受手术治疗的12例盆腔器官脱垂患者（pelvic organ prolapse，POP）的骶韧带为病例组；同期因子宫良性病变行子宫全切的12例非POP患者的骶韧带作为对照组。两组患者均无子宫内膜异位症、糖尿病及呼吸、消化、心血管系统等疾病，术前3个月内未应用性激素治疗。病例组与对照组在年龄、产次、孕次、体重指数等方面比较，差异无统计学意义。
　　2取材:经河北医科大学第二医院伦理委员会同意，所有患者签署知情同意书。所取标本为两组患者近宫颈部分的骶韧带组织，取新鲜组织一块-20℃冷盒送实验室用于组织蛋白提取；一块常温甲醛固定常规脱水包埋备用。另取正常患者近宫颈部分的骶韧带组织一块置于加双抗培养液中4℃冷盒送实验室，用于细胞培养，整个取材运输过程小于2小时。
　　3采用免疫组化及western blot方法对pop和非pop骶韧带组织中Integrinβ1和nesprin-2表达做定性及定量研究。
　　4培养和鉴定原代成纤维细胞:采用组织块法进行骶韧带成纤维细胞的原代培养，通过倒置相差显微镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。
　　5细胞力学实验:采用Flexcercell4000柔性基底拉伸加载系统，分别对3-5代处于对数期生长的非pop组骶韧带成纤维细胞加力，加载过程在二氧化碳培养箱内进行。加载参数:幅度15％，正弦波，O.5Hz，时间分别为:0，6，12，24小时。在设定的时间将细胞培养板取出立即在倒置相差显微镜下观察骶韧带成纤维细胞的形态再进行成纤维细胞蛋白提取，用免疫蛋白印记技术测定成纤维细胞在加力不同的时间后的integrinβ1和nesprin-2的表达。所得数据用spss21.0统计分析，以P<0.05认为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1免疫组化染色结果integrinβ1位于成纤维细胞的细胞膜，阳性呈棕黄色；nesprin-2位于细胞质和细胞核。用Western blot技术检测POP组与非POP组盆底骶韧带组织中integrinβ1和nesprin-2的表达结果显示:在盆底韧带正常组integrinβ1的表达和内参的比值是（2.09士0.12）在病例组是（1.29士0.04），P<0.05；在盆底韧带正常组nesprin-2的表达和内参的比值是（1.09士0.06）在病例组是（0.49士0.02），P<0.05；与正常组相比病例组中integrinβ1和nesprin-2的表达蛋白表达水平明显下调，差异具有统计学意义，表明在盆腔器官脱垂患者中细胞骨架降低。
　　2原代骶韧带成纤维细胞于培养接种后5天开始出现游离的细胞核，7-10天开始有细胞自组织块边缘游离出来，贴壁生长，细胞较大，多数呈梭形或不规则三角形，边界清楚；约15-20天左右单层细胞达80%-90%汇合时呈放射状、编织状排列(Fig.10)传代后完全伸展的骶韧带成纤维细胞呈扁平长梭形。
　　3培养的细胞波形蛋白表达于间质来源的细胞，角蛋白表达于上皮来源的细胞。将培养的细胞经免疫细胞化学染色，中间丝波形蛋白(vimentin)表达阳性，棕黄色颗粒定位于胞质；而角蛋白染色阴性，结合取材部位证实为骶韧带成纤维细胞。
　　4拉伸前骶韧带成纤维细胞形态多样，为长梭形或不规则三角形，其排列亦呈多向性，无明显规律；在15%应变作用下随着受力时间的延长，细胞表现出对力场的顺应性变化，较原代细胞更长，呈长梭形。
　　5原代培养的盆底韧带成纤维细胞在15%应变刺激下integrinβ1蛋白表达量和内参的比值在Oh，6h，12h，24h分别为(1.40士0.02，1.35士0.02，1.64士0.05，3.11士0.04)，0h与6h相比P>0.05差异无统计学意义；0h与12h、24h相比随着时间的延长表达量较0h显著上调，其中以24h上调最多，P<0.05差异有统计学意义。成纤维细胞在15%应变刺激下nesprin-2蛋白表达量和内参的比值在Oh，6h，12h，24h表达量分别为(0.40士0.06，0.64士0.02，0.60士0.04，2.45士0.06)，0h与6h、12h、24h相比P<0.05差异有统计学意义；6h与12h相比P>0.05差异无统计学意义；以0h作对照随着时间的延长表达量显著上调，其中以24h上调最多， P<0.05差异有统计学意义。
　　结论：
　　1机械力可以影响着骨架蛋白中integrinβ1和nesprin-2的表达含量，改变细胞的形态并对骶韧带成纤维细胞骨架适应的作用效果，控制细胞命运，调节信号传导，基因转录表达。
　　2非POP患者较POP患者具有更稳定的细胞骨架系统，POP患者integrinβ1和nesprin-2表达下降，在POP发病机制中起着重要作用。
　　3细胞骨架在生物力学对盆底功能障碍性疾病作用机制中扮演着重要角色。

目录

声明

前言

材料与方法

1 仪器

2 试剂

统计学分析

结果

附图

附表

讨论

1 细胞骨架

2 细胞的信号传导

3 机械力对成纤维细胞细胞骨架蛋白Integrinβ1和nesprin-2的影响

4 POP和非POP组细胞骨架蛋白的不同

结论

参考文献

综述:机械力对细胞的影响

致谢

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