NLRP3炎性体在HBV相关慢加急性肝功能衰竭中的作用

摘要

目的：
　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）相关慢加急性肝功能衰竭（acute on chronic liver failure, ACLF）是在慢性乙型肝病基础上出现的严重的肝细胞坏死、凋亡，继而引起严重的肝功能损害和各种并发症的临床综合征。其病情凶险，进展迅速，预后不良。目前大多数学者认为其发病机制与免疫损伤密切相关。有研究称：在肝衰竭患者的外周血中存在“免疫紊乱”状态，但目前尚无确切的指标能够明确患者的免疫状态。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NACHT-LRR-PYD-containing proteins3, NLRP3）炎性体是一种多蛋白复合体，属于固有免疫系统，通过识别外源性及内源性损伤因子发挥作用。研究发现其在急性肝衰竭发挥促炎作用，但其在HBV相关ACLF中的作用尚未阐明。本研究通过检测HBV相关ACLF患者外周血、肝组织中NLRP3、Caspase-1及细胞因子白细胞介素-1β（interleukin, IL-1β）、IL-18的表达，初步探讨NLRP3炎性体在HBV相关ACLF患者中的作用。
　　方法：
　　选取2016年1月至2016年10月河北医科大学第三医院门诊或住院患者，HBV相关ACLF患者30例（ACLF组）、CHB患者30例（CHB组）和健康体检者15例（健康对照组）。此外，收集接受肝移植的HBV相关ACLF患者肝组织8例、肝组织活检的CHB患者肝组织8例和正常供体肝组织5例。检测入组患者血清ALB、ALT、AST、TB、DB、INR、HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平。流式细胞学检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中NLRP3的表达量及表达位置。实时荧光定量（quantitative real-time）PCR检测PBMC、肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA的表达，并对PBMC进行磁珠分选，应用RT-qPCR分别检测CD14+单核细胞、CD14-PBMC细胞群中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达；免疫组织化学染色法检测肝组织中NLRP3的表达以及与CD68共同表达。
　　结果：
　　1一般资料：各组研究对象年龄、性别比例具有可比性。ACLF组患者血清ALT、AST、TB、DB、INR水平明显高于CHB组及健康对照组（P<0.01）；ACLF组患者 ALB、HBV DNA水平明显低于CHB组（P<0.01）。
　　2乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组外周血单个核细胞中NLRP3的表达下降
　　应用流式细胞学技术分析各组患者外周血单核细胞中NLRP3的表达水平（MFI），结果显示：ACLF组NLRP3的表达量明显低于CHB组和健康对照组（P＜0.01）。CHB组NLRP3的表达亦低于健康对照组（P＜0.01）。进一步分析ACLF中晚期和ACLF早期患者单核细胞中NLRP3的表达，结果显示：ACLF中晚期患者明显低于ACLF早期患者（P＜0.01）。
　　应用RT-qPCR检测PBMC中NLRP3的表达，结果显示：ACLF组NLRP3 mRNA水平低于CHB组和健康对照组（P＜0.05）。CHB组NLRP3 mRNA的表达亦低于健康对照组（P＜0.01）。
　　3 NLRP3主要表达在CD14+CD16+单核细胞群
　　NLRP3在单核细胞亚群中的表达：在CD14++CD16-单核细胞群和CD16++CD14-单核细胞群，ACLF组、CHB组、健康对照组中NLRP3的表达未见明显差异（P＞0.05）；在CD14+CD16+单核细胞群，ACLF组、CHB组均低于健康对照组（P＜0.01），ACLF组NLRP3的降低最为明显，尤其是ACLF中晚期患者。同时，应用CD14磁柱分离PBMC，分别检测CD14+单核细胞、CD14-PBMC中NLRP3 mRNA水平。ACLF组、CHB组CD14+单核细胞中NLRP3 mRNA水平明显低于健康对照组（P＜0.05），以ACLF组降低显著。而三组在CD14-PBMC细胞中NLRP3 mRNA的表达未见明显差异（P＞0.05）。
　　4乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组肝组织中NLRP3的表达升高
　　免疫组织化学染色结果显示：ACLF组肝组织中NLRP3的表达明显高于CHB组（P＜0.01），健康对照组肝组织未见NLRP3表达。NLRP3在汇管区与小叶内均有表达，以小叶内为主，CD68与NLRP3共染提示：NLRP3主要表达于肝小叶内kupffer细胞胞浆。
　　RT-qPCR检测肝组织中NLRP3 mRNA的表达显示：ACLF组NLRP3 mRNA的表达高于CHB组和健康对照组（P＜0.01）。CHB组NLRP3mRNA的表达亦高于健康对照组（P＜0.01）。
　　5乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组外周血单个核细胞中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达下降
　　RT-qPCR检测PBMC中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达显示：ACLF组Caspase-1、IL-1βmRNA水平均低于CHB组Caspase-1、IL-1β水平，IL-18 mRNA于两组未见明显差异（P＞0.05），ACLF组与健康对照组mRNA水平未见明显差异（P＞0.05）。
　　PT-qPCR检测CD14磁珠分选后Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达显示：ACLF组CD14+单核细胞Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达低于CHB组Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA水平，ACLF组CD14-PBMC中Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达低于CHB组Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达。ACLF组与健康对照组未见明显差异（P＞0.05）。
　　6乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组肝组织中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达升高
　　RT-qPCR检测肝组织中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18mRNA的表达显示：ACLF组IL-1βmRNA、IL-18mRNA的表达均高于CHB组及健康对照组（P＜0.05或P＜0.01）。ACLF组Caspase-1mRNA的表达与CHB组差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　7 ACLF组患者CD14+CD16+单核细胞NLRP3的表达量与患者MELD评分呈负相关（R=-0.74），相关具有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论：
　　1 NLRP3炎性体在HBV相关慢加急性肝功能衰竭患者外周血表达降低，可能与免疫抑制有关。
　　2 NLRP3主要表达于CD14+CD16+单核细胞，通过向肝脏募集，造成肝脏损伤。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 仪器设备

2 主要试剂

3 主要溶液的配制

4 实验方法

5 统计学处理

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:炎性体与非酒精性脂肪性肝炎

致谢

个人简历