头部浅低温对大鼠脑缺血再灌注海马CA1区GLT-1表达及细胞外谷氨酸浓度的影响

摘要

目的:
　　本实验采用改良的Pulsinelli四血管阻断(4-Vessel occlusion,4VO)法制备大鼠全脑缺血再灌注模型，鼻咽腔降温法维持头部浅低温，微透析技术收集大鼠海马CA1区微透析液并测定其中谷氨酸(Glutamic acid，Glu)浓度([Glu]e)，比较在头部浅低温条件下应用谷氨酸转运体(Glutamate transporter1，GLT-1)特异性抑制剂二氢卡因酸盐(Dihydrokainate，DHK)或应用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002后，对海马CA1区GLT-1表达及细胞外谷氨酸浓度影响，评价磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信号通路调控GLT-1表达在脑缺血再灌注损伤中的影响，为治疗性低温在临床应用提供参考。
　　方法：
　　1实验动物分组
　　健康雄性清洁级Wistar大鼠30只（由河北医科大学实验动物中心提供）。采用随机数字表法将大鼠随机分配为5组(n=6)：假手术组(Sham组/S组)、常温缺血再灌注组(IN组)、低温缺血再灌注组(IH组)、GLT-1特异性抑制剂组(DHK组)、PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002组(LY组)。
　　2动物模型制备
　　采用改良的Pulsinelli四血管阻断法(4-Vessel occlusion,4VO)制备全脑缺血再灌注模型，鼻咽腔降温法制备头部浅低温模型。
　　(1)假手术组(Sham组/S组)(n=6)：仅暴露双侧椎动脉但不烧灼，仅分离双侧颈总动脉但不夹闭。
　　(2)常温缺血/再灌注组(IN组)(n=6)：永久热凝闭双侧椎动脉，48小时后暴露双侧颈总动脉穿线并夹闭双侧8 min恢复灌注。
　　(3)低温缺血再灌注组(IH组)(n=6)：永久热凝闭大鼠双侧椎动脉，48小时后分离双侧颈总动脉穿线备用，鼻咽腔降温法持续低温，维持海马温度(33.0±0.5)℃，夹闭双侧颈总动脉8 min后复灌。
　　(4) GLT-1特异性抑制剂组(DHK组)(n=6)：永久热凝闭双侧椎动脉，48小时后暴露双侧颈总动脉，鼻咽腔降温至目标温度持续收集细胞外液，夹闭双侧颈总动脉前30 min，右侧脑室缓慢注射DHK溶液20μl（200 nmol），夹闭双侧颈总动脉8 min复灌。
　　(5) LY294002组(LY组)(n=6)：永久热凝闭双侧椎动脉，48小时后暴露双侧颈总动脉，夹闭双侧颈总动脉前20 min，右侧脑室缓慢注射5μl LY294002(LY294002溶于DMSO中，浓度为25mmol/L)，夹闭双侧颈总动脉8 min复灌。
　　以上各组均须同时监测直肠温度，并维持其在(37±0.5)℃。
　　3标本采集及检测方法
　　3.1微透析液的收集时间及测定
　　大鼠全脑缺血前20min～10min，记为t0；全脑缺血前10min～缺血前，记为t1；缺血即刻～10min，记为t2；缺血后10min～20min，记为t3；缺血后20min～30min，记为t4；缺血后30min～40min，记为t5。
　　收集各组大鼠微透析液并密封保存于－80℃冰箱，应用高效液相色谱(HPLC)法测定谷氨酸标准品在不同浓度的峰面积，绘制标准曲线并计算标准曲线回归方程，从而得出微透析液中谷氨酸浓度([Glu]e)变化。
　　3.2免疫组化测定海马CA1区Bax、Bcl-2、pAkt和GLT-1蛋白表达
　　各组大鼠微透析液收集完成后，继续维持头部浅低温(33±0.5)℃，直肠温度维持在(37±0.5)℃，待2小时后自然复温。各组大鼠于缺血再灌注8 h断头取脑，使用4％多聚甲醛固定脑组织，应用免疫组化技术观察Bax、Bcl-2、GLT-1和pAkt蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1大鼠海马CA1区[Glu]e比较
　　与t0比较，各组t1、t5[Glu]e均无明显改变（P>0.05），t2、t3、t4[Glu]e差异有统计学意义（P<0.05）。t2时，IN组、DHK组、LY组[Glu]e明显高于S组与IH组，差异有统计学意义（P<0.05）；t3时，DHK组与LY组之间差异无统计学意义（P>0.05），S组、IH组、DHK组、LY组[Glu]e均低于IN组，差异有统计学意义（P<0.05）；t4时，DHK、LY组高于Sham组[Glu]e，IH组[Glu]e低于LY组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2各组大鼠海马CA1区Bax、Bcl-2表达的免疫组化比较
　　与S组比较，IN组、DHK组、LY组Bax表上达调，Bcl-2表达下调， IH组Bcl-2表达上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与IN组相比，IH组、DHK组、LY组Bax表达下调，Bcl-2表达上调，差异有统计学意义（P<0.05）；与IH组相比，DHK组、LY组Bax表达上调，Bcl-2表达下调，差异有统计学意义（P<0.05）；DHK组、LY组两组相比差异无统计学意义（P>0.05）。
　　3各组大鼠海马CA1区pAkt蛋白表达的免疫组化比较
　　与S组比较，IN组、LY组pAkt表达下调，IH组、DHK组pAkt表达上调（P<0.05）；与IN组相比，IH组、DHK组pAkt蛋白表达上调， LY组pAkt表达下调（P<0.05）；与IH组相比，DHK组、LY组pAkt表达下调（P<0.05）；与DHK组相比，LY组pAkt表达下调（P<0.05）。
　　4各组大鼠海马CA1区GLT-1蛋白表达的免疫组化比较
　　海马CA1区星形胶质细胞中GLT-1蛋白均有表达。S组有少量棕黄色GLT-1蛋白阳性免疫颗粒。与S组比较，IN组GLT-1表达下调，IH组、DHK组GLT-1表达上调（P<0.05）；与IN组相比，IH组、DHK组、LY组GLT-1表达上调（P<0.05）；与IH组相比，DHK组、LY组GLT-1表达下调（P<0.05）；与DHK组相比，LY组GLT-1表达下调（P<0.05）。
　　结论：
　　1头部浅低温可有效减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤。
　　2头部浅低温通过上调海马CA1区GLT-1表达，降低细胞外谷氨酸浓度，减轻其兴奋性毒性作用，从而发挥脑保护作用。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 主要实验仪器和试剂

2 实验动物分组及各组处理方法

3微透析操作、微透析液收集时间及保存

4 鼻咽腔降温[7]

5 侧脑室注射

6 高效液相色谱法测定微透析液谷氨酸浓度[9-10]

7蛋白表达的免疫组化测定

8 统计学处理

结果

3 各组大鼠海马CA1区pAkt蛋白表达的免疫组化比较

4 各组大鼠海马CA1区GLT-1蛋白表达的免疫组化比较

附图

附表

讨论

1 模型制备及实验目标温度的选择

2 鼻咽腔降温法通过PI3K/Akt信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

3 头部浅低温对细胞外液[Glu]e及GLT-1的影响

4 应用LY294002阻断PI3K/Akt信号通路对细胞外液[Glu]e及GLT-1的影响

结论

参考文献

综述:创伤性颅脑损伤目标温度管理研究进展

致谢

个人简历