基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析冬凌草的化学成分及冬凌草甲素体外代谢研究

摘要

冬凌草为唇形科（Labtea）香茶菜属（Isodon）植物碎米桠（Isodon rubescens（Hemsl.）Hara）的干燥地上部分，以草质部分入药。临床上主要用于治疗扁桃体炎、咽喉肿痛，胃炎和感冒发热等症状，同时对原发性肝癌、食管癌、肺癌、责门癌、前列腺癌等有一定的疗效。冬凌草产地广泛，不同来源的冬凌草的化学成分存在明显差异，且香茶菜属植物的外观相似，药材市场上该药材植物的来源缺乏规范管理。二萜类化合物是冬凌草中的一类主要的活性成分，由于种类多样且含量较低，采用传统的方法很难有效地控制该药材的质量。因此，研究采用一种新颖有效的检测技术来控制和鉴定冬凌草中的二萜类成分对于药材的质量评价具有十分重要的意义。SWATH（Sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra）技术分析能力强，能够获得二级质谱图较高的命中率和质量，有望成为中药成分定性研究的有力工具。本研究建立了UHPLC-Q-TOF-MS/MS法联合 SWATH技术对冬凌草中微量和痕量二萜类化学成分进行了快速分析和结构鉴定，从而为全面深入开发利用二萜类活性成分提供技术支持。同时采用主成分分析法（PCA）法对药材进行质量分析，为冬凌草的质量评价和合理用药提供了理论基础。
　　冬凌草甲素为香茶菜属（Isodon）植物冬凌草中分离出的主要活性成分，系对映-贝壳杉烷二萜类（ent-kaurane diterpenoid）天然有机化合物。大量研究发现，该成分在抗肿瘤、抗癌、抗炎等方面显示出较强的药理活性。药物的体外代谢研究是新药研究的重要组成部分，对阐明药物代谢类型和代谢途径、评价药物的安全性有着重要的意义。因此，本文建立体外肝微粒体孵育体系，采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，测定了冬凌草甲素在人、猴、大鼠和小鼠肝微粒体孵育样品中的代谢产物，总结了冬凌草甲素在体外代谢物的质谱裂解规律，分析比较了不同种属肝微粒体的代谢差异，期望及早从动物体内外研究结果推到人而提供参考。
　　第一部分：基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS和SWATH技术快速识别和鉴定冬凌草中二萜类成分
　　目的：建立基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS中SWATH在线检测技术，快速识别和鉴定冬凌草中的微量和痕量二萜类成分的方法。同时应用PCA分析法寻找影响药材产地质量的差异成分。
　　方法：首先建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS中SWATH技术，通过电喷雾离子源（ESI）负离子全扫描模式获取一级离子，采用 SWATH模式扫描二级质谱离子，研究和探讨了9个具有代表性的二萜类化学成分对照品的质谱裂解途径，总结其裂解规律。其次将冬凌草药材甲醇提取液在SWATH模式下进行TOF-MS全扫描，获得总离子流图。然后将数据库中已知的分子化学式输入数据处理软件MasterView中，对于误差范围在±5 ppm内的色谱峰基于精确分子质量和一级离子、二级离子质谱图，结合对映-贝壳杉烷二萜类成分的裂解规律和文献中已报道的化合物的裂解途径进行筛选和鉴定。最后对24批冬凌草中鉴定识别的60种二萜类化学成分计算相对峰面积，基于峰面积数值采用PCA法找出了影响药材产地质量的差异化学成分。色谱柱为菲罗门Kinetex C18柱（100 mm×3.0 mm,2.6μm）色谱柱，柱前接有预柱Phenomenex Kinetex C18柱（4.0 mm×3.0 mm,2.6μm）保护柱，柱温25℃，流动相为甲醇和水溶液，梯度洗脱，分析时间为37 min，流速为0.3 mL/min，进样体积为2μL。
　　结果：应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS中SWATH技术首次分析鉴定了冬凌草中60个对映-贝壳杉烷二萜类化合物，包括33个7，20-环氧类型C-20位被氧化的对映贝壳杉烷类，7个延命素型对映-6，7-断裂-贝壳杉烷型二萜化合物，3个7，20:14，20-二环氧类型的C-20位被氧化的对映-贝壳杉烷类，2个螺内酯型对映-6，7-断裂-贝壳杉烷型二萜化合物，5个C-20氧化无氧环的对映-贝壳杉烷二萜类化合物，10个C-20未氧化的对映-贝壳杉烷二萜类化合物。同时总结了冬凌草中不同母核亚型二萜类成分的质谱裂解规律。PCA得分散点图表明，24批样品被明显的聚为两大类，阐明产地对冬凌草的质量差异会产生一定影响。另外，也找出了影响药材质量的主要差异成分。
　　结论：本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS结合SWATH技术快速识别鉴定了冬凌草中60种对映-贝壳杉烷二萜类化合物。这种方法体现了高灵敏度、高准确度、高专属性的分析特点。PCA法对冬凌草产地质量差异的评价和分析为合理用药及节约药材资源提供了宝贵的借鉴和参考。
　　第二部分：冬凌草甲素在不同种属肝微粒体中的代谢研究
　　目的：建立灵敏专属的UHPLC-Q-TOF-MS/MS法测定冬凌草甲素在人、猴、大鼠和小鼠肝微粒体孵育样品中的代谢产物，同时研究和阐明冬凌草甲素在体外的代谢类型和代谢途径，并采用PCA法探讨冬凌草甲素在不同种属中的代谢差异。
　　方法：建立冬凌草甲素在4个种属中的肝微粒体温孵体系，对所得的空白，对照和样品组进行涡旋离心，取上清液进入 UHPLC-Q-TOF-MS/MS系统进行检测。首先采用 UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术进行数据全扫描，同时利用多重质量亏损模板（MDF）结合动态背景扣除（DBS）方法触发依赖信息数据采集（IDA），而后应用多种数据后处理方法进行代谢物的筛选，比如提取离子（XIC），质量亏损过滤（MDF），子离子过滤（PIF）和中性过滤（NLF）等方法获得二级质谱信息。基于精确质量数和母药的裂解规律，对冬凌草可能的代谢物进行结构推测，同时应用C log P对代谢物中同分异构体进行区分。实验采用 Kinetex C18柱（100 mm×3.0 mm,2.6μm）色谱柱进行分离，柱温为25℃，梯度洗脱，流动相为甲醇-水溶液，流速为0.4 mL/min，运行时间共为15 min，进样体积为5μL。同时，采用相对峰面积法计算出各个代谢物在不同种属肝微粒体中的相对含量，利用SPSS软件中的PCA分析方法，分析出4种肝微粒体温孵后产生代谢产物的相似和不同，并且与之前冬凌草甲素的体内代谢数据进行了比对。
　　结果：本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术共鉴定出冬凌草甲素在人、猴、大鼠和小鼠肝微粒体孵育体系中的27个代谢产物，均为一相代谢物，上述四个不同种属的肝微粒体中分别鉴定出2、5、14和24个代谢物。同时推断了冬凌草甲素在体外可能的代谢途径，其主要代谢途径为双羟基化反应和脱水反应。PCA结果表明人和猴肝微粒体代谢产物可以聚为一类，而大鼠和小鼠肝微粒体代谢产物则聚为另一类，表明冬凌草甲素在不同种属中的代谢存在一定的差异，且在进一步的药理毒理实验中，猴可以代替人作为最佳实验模型。
　　结论：本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法，首次成功分析和鉴定了冬凌草甲素在不同种属肝微粒体中的代谢物，同时采用PCA法分析比较了冬凌草甲素产物生成的种属差异，为冬凌草甲素在体外过程的阐明和药理学研究奠定了基础，同时期望及早从动物体外结果推到人而提供借鉴和参考。该方法灵敏、快速、有效，可用于其他单体成分在肝微粒体中的研究。

目录

英文缩写

引言

第一部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS和SWATH技术快速识别和鉴定冬凌草中二萜类成分

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分冬凌草甲素在不同种属肝微粒体中的代谢研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:香茶菜属二萜类化合物分析方法研究概况

致谢

个人简历