非小细胞肺癌细胞EMT与失巢凋亡抵抗相关性的实验研究

摘要

目的：
　　肿瘤的侵袭转移与患者的生存及预后密切相关。失巢凋亡（Anoikis）指细胞脱离原来生长部位，失去细胞-细胞、细胞-胞外基质间黏附而发生的一种程序性死亡。然而恶性肿瘤细胞常常通过多种方式获得对失巢后凋亡的抵抗能力，从而利于肿瘤的侵袭与转移。有研究表明，细胞发生上皮间质转化（Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT）与失巢凋亡抵抗相关。由于EMT与失巢凋亡抵抗同为参与肿瘤转移的关键过程，揭示两者间的相关性对于阐明肿瘤的转移机制至关重要。基于此，本研究利用转化生长因子β（TGF-β）长期处理非小细胞肺癌细胞株获得EMT模型，观察细胞EMT后迁移力及失巢凋亡抵抗的影响；同时观察细胞在失巢状态下EMT相关分子表达的变化，从上述两方面探讨EMT与失巢凋亡抵抗的相关性。
　　方法：
　　1.细胞培养
　　人非小细胞肺癌H358及A549细胞株，培养于含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基，37℃、5%CO2培养，细胞贴壁生长，常规传代。
　　2.TGF-β1长期处理细胞
　　给予H358及A549细胞5ng/mL TGF-β1长期处理，构建EMT细胞模型（标记为：H358-TGF-β，A549-TGF-β），于处理后21天收集细胞检测EMT相关分子的表达。
　　3.细胞强制失巢处理
　　将浓度为10mg/mL的Poly-HEMA溶液铺于6孔培养板，每孔体积1.5mL，过夜干燥备用。将调整好浓度的细胞悬液均匀铺于板中，37℃，5%CO2培养。
　　4.Real-time PCR
　　提取细胞总RNA，应用Real-time PCR方法，检测H358/H358-TGF-β、A549/A549-TGF-β细胞在贴壁（Attached，A）及失巢（Detached，D）状态下EMT相关分子（CDH1、CDH2、Vimentin、Snail、ZEB1及ZEB2）mRNA水平的表达情况。参照Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct（ΔΔCt）方法计算目的基因的相对表达量。
　　5.蛋白免疫印迹（Western blot）
　　提取细胞总蛋白，采用蛋白免疫印迹方法检测上述细胞在A或D状态下EMT相关分子E-cadherin（E-Ca）、N-cadherin（N-Ca）、Vimentin、Snail在蛋白水平的表达情况。
　　6.细胞划痕实验
　　分别于划痕后0-72h观察细胞在划线两侧的生长情况，于显微镜下观察并拍照，每组实验重复三次。
　　7.Transwell小室迁移实验
　　2~6×104个细胞接种于小室上层，于接种后不同时间，固定染色后于显微镜下观察下室细胞的迁移情况。倒置显微镜下任取10个视野，计数穿膜细胞的平均值。每组实验重复三次。
　　8.FCM检测细胞凋亡
　　采用Annexin-V/PE试剂盒，通过流式细胞仪检测各组细胞在A或D状态下的凋亡情况，应用FlowJo7.6软件进行数据分析。
　　9.台盼蓝计数死细胞
　　采用台盼蓝染色方法，观察各组细胞在A或D状态下的死亡情况。10统计方法
　　应用SPSS Statistics17.0软件进行分析，数据分析采用两样本t检验，计量资料以均数±标准差（x±SD）表示。P<0.05认为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.TGF-β1长期处理H358、A549细胞构建EMT细胞模型
　　1.1.细胞形态改变：
　　分别给予H358与A549细胞TGF-β1连续处理21天，细胞形态发生明显改变。与各自原始细胞相比，H358-TGF-β及A549-TGF-β细胞均变为细长，类似于纺锤体形，形态改变支持细胞发生上皮向间叶样转变（EMT）。
　　1.2.EMT相关分子的表达情况：
　　1.2.1.TGF-β1长期处理H358细胞：
　　TGF-β1处理后7-21天，细胞中上皮标记分子E-Ca在mRNA及蛋白水平均显著低于未处理组细胞，而间叶标记分子CDH2、Vimentin及Snail在两个水平均升高。以上结果证实，TGF-β1连续刺激21天诱导H358细胞发生EMT转化，细胞标记为H358-TGF-β。
　　1.2.2.TGF-β1长期处理A549细胞：
　　给予A549细胞TGF-β1连续刺激21天，上皮标记分子E-Ca在mRNA及蛋白水平均显著低于未处理组细胞；而间叶标志物N-cadherin、Vimentin及Snail表达逐渐增加。综合考虑mRNA水平及蛋白表达结果，后续实验选择连续给予TGF-β121天作为EMT细胞模型，细胞标记为A549-TGF-β。1.3细胞迁移力的改变：
　　划痕实验结果显示，H358-TGF-β细胞划痕愈合面积（62.6±2.5%）明显大于对照组（9.3±0.83%），差异有统计学意义；与A549细胞相比， A549-TGF-β细胞划痕愈合面积显著增高（47.7±2.08%V.S.98.6±0.65%，P<0.05）。此外，Transwell实验结果同样表明，H358-TGF-β、A549-TGF-β细胞穿入下室的细胞数显著高于各自的对照组细胞（均P<0.05）。
　　综上，TGF-β1长期处理可诱导H358和A549细胞发生EMT转化，同时细胞迁移力亦显著增强。
　　2.细胞EMT后对失巢凋亡抵抗的检测
　　2.1.失巢条件下细胞形态的变化：
　　失巢培养48小时后，光镜下观察细胞以大小不等的微球方式生长，折光性强。H358细胞间结合紧密，呈串珠状聚集，而H358-TGF-β细胞间结合较疏松，散在分布。与原始细胞相比，A549-TGF-β细胞间排列更为疏松。
　　2.2.贴壁及失巢条件下细胞凋亡的检测：
　　消化细胞制备细胞悬液，分为2组分别在贴壁与失巢条件下进行培养，48小时后收集细胞采用Annexin V-PE染色检测细胞凋亡情况。
　　2.2.1.贴壁状态下细胞凋亡检测：
　　与H358相比，H358-TGF-β细胞凋亡率降低（11.67±1.36%V.S.5.52±0.22%，P<0.05）。但是A549-TGF-β细胞凋亡率与A549相比无显著变化（P＞0.05）。
　　2.2.2.失巢状态下细胞凋亡显著增加：
　　与细胞贴壁生长相比，各细胞在失巢状态下凋亡率均显著增加，P值均小于0.05。[H358：11.67%±1.36%（A），51.35%±1.34%（D）；H358-TGF-β：5.52%±0.22%（A），22.0%±0.42%（D）；A549：5.2±0.28%（A），24.22±3.75%（D）；A549-TGF-β：4.24±1.56%（A），10.65±0.21%（D）]。
　　2.2.3.细胞EMT后可抵抗失巢凋亡：
　　失巢状态下，H358-TGF-β细胞的凋亡率（22%±0.42%）显著低于H358细胞（51.35%±1.34%，P<0.05）。此外，A549-TGF-β细胞在失巢状态下的凋亡率明显低于A549细胞（10.65±0.21%V.S.24.22±3.75%，P<0.05）。上述结果表明，细胞发生EMT后，能够耐受失巢引起的细胞凋亡，表现为失巢凋亡抵抗。
　　2.3.台盼蓝染色计数细胞死亡情况：
　　台盼蓝染色结果显示，各组细胞在失巢与贴壁条件下培养，死细胞率无明显差别（P＞0.05），结果表明失巢培养48h后细胞为存活状态。
　　3.失巢状态下细胞EMT相关分子表达的变化
　　分别于失巢与贴壁状态下收集细胞提取总RNA及总蛋白，采用Real-time PCR方法与Western Blot方法，检测EMT相关分子在mRNA及蛋白水平的表达情况。
　　3.1.H358/H358-TGF-β细胞：
　　3.1.1.H358细胞：
　　在mRNA水平，与贴壁状态相比（作为1），失巢后H358细胞间叶标记分子Snail（FC=2.57）及ZEB2（FC=1.56）mRNA表达增高，CDH2 mRNA表达降低（FC=0.10），其他指标无显著变化。在蛋白水平，细胞失巢后Snail蛋白及Vimentin表达增高，E-Ca蛋白表达无明显变化。
　　3.1.2.H358-TGF-β细胞：
　　与贴壁组细胞相比，失巢组细胞上皮标记分子CDH1 mRNA表达降低（FC=0.21），间叶标记分子Snail、ZEB1及ZEB2 mRNA的表达均显著增加，CDH2及Vimentin mRNA表达无显著变化。Western bolt检测结果显示，失巢后H358-TGF-β细胞E-Ca蛋白表达降低，Vimentin及Snail蛋白表达增高。
　　上述结果提示：失巢状态下H358和H358-TGF-β细胞间叶标记分子表达增加，以H358-TGF-β细胞更为显著。
　　3.2.A549/A549-TGF-β细胞EMT相关基因表达情况：
　　3.2.1.A549细胞：
　　A549细胞失巢后，E-cadherin在mRNA水平（CDH1）及蛋白（E-Ca）水平表达均低于贴壁状态。Vimentin、Snail、ZEB1及ZEB2 mRNA的表达均升高，CDH2 mRNA水平无明显变化。同时，失巢后Vimentin及Snail蛋白表达较贴壁状态增加。
　　3.2.2.A549-TGF-β细胞：
　　与贴壁状态相比，失巢后细胞中CDH1 mRNA表达升高，但其蛋白水平未见显著变化。Vimentin、Snail、ZEB1及ZEB2 mRNA的表达均升高，同时Snail蛋白表达量亦显著升高。综合mRNA及蛋白水平的检测结果，提示失巢条件下A549/A549-TGF-β细胞中间叶标记分子表达显著增加。
　　结论：
　　1.给予A549、H358细胞TGF-β1长期处理可诱导细胞发生EMT转换，同时伴随迁移能力显著增强。
　　2.H358、H358-TGF-β、A549及A549-TGF-β细胞在失巢状态下细胞凋亡显著高于贴壁状态；细胞发生EMT后表现为对失巢凋亡的抵抗。
　　3.无论是原始细胞还是诱导EMT后的细胞模型中，失巢后细胞间叶标记分子的表达均出现一定程度地增加，同时伴或不伴上皮标记分子E-Ca的降低，提示细胞在失巢后倾向于保持在（部分）EMT状态。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 TGF-β1长期处理H358、A549细胞构建EMT细胞模型

2 细胞EMT后对失巢凋亡抵抗的检测

3 失巢状态下细胞EMT相关分子表达的变化

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:Anoikis分子途径及其在肿瘤进展中的作用

致谢

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