C末端调节蛋白在糖尿病肾脏细胞外基质沉积中的作用

摘要

目的：糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最主要的并发症，严重影响患者的生存质量和生命。它的病理特征主要表现为细胞外基质的积聚，肾小管上皮细胞的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及肾小球硬化和肾小管间质纤维化，并最终导致肾功能的进行性衰竭。胶原是细胞外基质最主要的组成成分，大约有28种不同胶原类型被发现，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原是较为常见的。另外，转化生长因子β1（transforming growth factorβ1, TGF-β1）及α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin,α-SMA）在多种器官和组织中均是公认的调节细胞外基质代谢的关键因子。
　　PI3K/Akt是一种多功能信号通路，具有介导细胞增殖、分化、迁移、脂质代谢及纤维化等的活性。PI3Ks通过磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）肌醇环的第3位碳原子，而形成PIP3，进而激活Akt（又称蛋白激酶B，protein kinase B, PKB）而发挥多种生物学功能。新近研究揭示PI3K/Akt信号通路与糖尿病肾病纤维化的发生相关。我们前期的研究也揭示PI3K/Akt信号通路能够上调TGF-β1及固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1, SREBP-1）的表达，介导高糖诱导的人肾小管上皮细胞脂滴合成和细胞外基质的积聚。因此，针对PI3K/Akt通路进行调控干预，成为防治糖尿病肾小球和肾小管病变的研究热点。
　　研究揭示PI3K/Akt通路的负向调控因子有SH2结构含磷酸肌醇（SH2 domain-containing inositol5’-phosphatase, SHIP）、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten, PTEN）和C末端调节蛋白（carboxyl-terminal modulator protein,CTMP）等。我们前期的研究发现PTEN通过抑制Akt的活性能下调SREBP-1/FASN/ACC信号途径及人肾小管上皮细胞的脂肪酸合成，同时还能抑制糖尿病小鼠肾脏结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）的表达及细胞外基质的分泌。然而CTMP在糖尿病肾病细胞外基质沉积的影响却未见报道。
　　因此，本研究应用糖尿病小鼠模型以及体外高糖刺激的人肾小管上皮细胞为研究对象，从动物及细胞水平上整体观察糖尿病肾脏中CTMP蛋白表达情况，以及过表达的CTMP对磷酸化Akt（phospho-Akt(Ser473)）、TGF-β1、α-SMA等蛋白的表达及细胞外基质沉积的影响。
　　方法：
　　1、 phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA、ColⅢ及FN在糖尿病小鼠肾脏的表达和意义
　　将CD1小鼠随机分为两组：分别为正常对照组（normal control group, N组）以及糖尿病组（diabetes mellitus group, DM组），每组各10只。糖尿病小鼠模型采用腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ,溶于0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液中，pH值为4.5，150 mg/kg），对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液，48 h后尾尖取血测量血糖，血糖≥16.7 mmol/L者确定造模成功，未达标者舍弃。于造模成功8周后处死小鼠，于处死前1天将各组小鼠在代谢笼中单独饲养收集24 h尿液，用于记录尿量，测量24 h尿蛋白水平。禁食6-8 h，将小鼠称重后异氟烷吸入麻醉，随后摘眼球取血，并迅速离心分离血清，用于血肌酐、血糖和血尿素氮的测定；取部分肾皮质组织经液氮速冻后保存于-80℃冰箱，用于提取蛋白及RNA；另外部分肾组织置于4％多聚甲醛固定，用于石蜡包埋及制片。应用Western blot、免疫组化以及 Real-time PCR观察糖尿病小鼠肾脏phospho-Akt、CTMP、TGF-β1、α-SMA、Ⅲ型胶原（CollagenⅢ, ColⅢ）、纤维粘连蛋白（Fibronectin, FN）蛋白及CTMP mRNA的表达。
　　2、高糖对人肾小管上皮细胞phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA表达和ColⅠ、ColⅢ分泌的影响
　　人肾小管上皮细胞（HKC细胞）用含100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素以及10%胎牛血清的DMEM培养基培养，并随机分为正常糖对照组（5.5 mmol/L glucose,Control）以及高糖组（30 mmol/L glucose, HG），并于高糖刺激后0、6、12、24以及48 h收集细胞，提取总蛋白，Western blot检测phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA蛋白的表达；免疫细胞荧光检测CTMP蛋白表达和定位；细胞上清液中Ⅰ型胶原（CollagenⅠ, ColⅠ）、ColⅢ分泌情况采用ELISA方法检测。
　　3、 CTMP表达质粒对高糖刺激人肾小管上皮细胞内phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA表达和ColⅠ、ColⅢ分泌的影响
　　人肾小管上皮细胞采用DMEM培养基进行培养（其中含有10%胎牛血清及100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素），培养条件为37℃，5%CO2。应用Lipofectamine2000转染试剂将pYr-ads-4-CTMP表达质粒转染入HKC，经G418筛选，建立HKC CTMP基因转染稳定细胞系，将细胞随机分为4组：正常糖对照组（5.5 mmol/L glucose,Control），高糖组（30 mmol/L glucose, HG），高糖及pYr-adshuttle-4空质粒对照组（HG+V），高糖及pYr-ads-4-CTMP质粒转染组（HG+CTMP）。后三组给予高糖刺激48 h后终止培养，进行免疫荧光染色和蛋白提取。采用Western blot检测phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA蛋白表达，ELISA方法检测ColⅠ、ColⅢ分泌情况。
　　4、 CTMP表达质粒对糖尿病小鼠肾脏内phospho-Akt(Ser473)、CTMP、TGF-β1、α-SMA、ColⅢ、FN表达及细胞外基质沉积的影响
　　将CD1小鼠随机分为四组：分别为正常对照组（Control组）、糖尿病组（DM组）、糖尿病+空质粒组（DM+V）和糖尿病+CTMP质粒组（DM+CTMP），每组10只。质粒注射组小鼠在成模4周后，分别给予尾静脉快速注射pYr-ads-4-CTMP质粒或 pYr-adshuttle-4质粒(1 mg/kg body weight)。此后每隔7天注射一次，共注射4次，之后处死小鼠并收集保存标本进行相关检测。
　　结果：
　　1、糖尿病小鼠肾脏 CTMP表达降低伴随 phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1、α-SMA和细胞外基质的表达增加
　　同正常对照组小鼠相比，糖尿病小鼠血糖、24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平分别是正常对照组的4.92、2.84、1.66及7.12倍。免疫组织化学检测发现，CTMP主要定位于正常对照组小鼠肾小管上皮细胞的胞浆，肾小球内未见明确表达；而糖尿病小鼠肾脏CTMP表达较弱，Image-Pro Plus（IPP）软件分析阳性区域积分光密度值（integrated optical density, IOD）比正常对照组小鼠降低了63.33%。同样地，通过Western blot技术进一步检测了各组小鼠肾脏CTMP蛋白的表达，结果发现相对于正常对照组，糖尿病组小鼠肾脏内CTMP的表达下降了37.7%。
　　免疫组织化学结果显示phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA在糖尿病小鼠肾小管上皮细胞的胞浆中均有显著表达，而正常对照组表达较弱。Western blot进一步检测了蛋白的表达并进行半定量分析发现，糖尿病小鼠肾脏phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1以及α-SMA的表达较正常对照组分别上调了3.66、1.29及2.33倍。
　　Masson染色结果显示糖尿病小鼠肾小管间质中可见灶性阳性信号分布，提示出现了细胞外基质的沉积，而正常对照组未见明确阳性表达。另外，为了进一步验证糖尿病小鼠肾脏细胞外基质的沉积情况，我们采用免疫组化染色检测了ColⅢ及FN的表达，结果提示糖尿病组小鼠肾脏内出现显著的阳性表达，主要定位于肾小管上皮细胞的间质内，而正常对照组小鼠肾脏内未见明显表达。IPP软件分析ColⅢ及FN阳性区域积分光密度值（IOD）分别是正常对照组的1.99及2.82倍。
　　2、高糖抑制人肾小管上皮细胞CTMP表达，并诱导phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1、α-SMA的上调及 ColⅠ、ColⅢ的分泌
　　Western blot检测了0~48 h不同时间点高糖刺激对人肾小管上皮细胞CTMP、phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1及α-SMA表达的影响。结果显示：CTMP蛋白在高糖刺激0 h时存在一定量的表达，且随着刺激时间的延长而逐渐减少，并于高糖刺激后24 h达到最低点。免疫荧光染色显示CTMP主要定位于人肾小管上皮细胞的胞浆，高糖刺激后CTMP表达明显减弱。相反地，phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1及α-SMA蛋白的表达随着高糖刺激时间的延长而逐渐升高，并于高糖刺激后24 h达到高峰，而总Akt的表达在各个时间点未见显著差异。
　　ELISA技术检测了高糖刺激后0h及48 h两个时间点细胞上清液中ColⅠ、ColⅢ的分泌情况。结果提示高糖刺激后48 h ColⅠ、ColⅢ的分泌较0h显著增加。
　　3、 CTMP表达质粒逆转高糖诱导下人肾小管上皮细胞CTMP的下调以及phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA的过表达
　　研究结果揭示pYr-ads-4-CTMP质粒转染成功上调了人肾小管上皮细胞CTMP的表达，经Western blot定量分析显示：与pYr-adshuttle-4空质粒组相比，pYr-ads-4-CTMP质粒使CTMP的表达上调了1.98倍。相反地， phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1及α-SMA的表达分别下调了35.11%、76.53%及51.59%，而总Akt的表达未见显著差异。进一步，我们采用ELISA技术检测了各组细胞上清液中ColⅠ和ColⅢ的分泌情况，结果显示高糖刺激后48 h ColⅠ、ColⅢ的分泌较0 h显著增加（P<0.05），而经pYr-ads-4-CTMP质粒转染后，ColⅠ、ColⅢ的表达分别下调了32.31%及51.83%。
　　4、 CTMP表达质粒上调糖尿病小鼠肾脏CTMP的表达并抑制Akt活化、TGF-β1、α-SMA的表达及细胞外基质的沉积
　　与pYr-adshuttle-4空质粒组相比，经pYr-ads-4-CTMP质粒转染后，糖尿病小鼠血肌酐、血尿素氮及24 h尿蛋白的水平均显著降低。RT-PCR结果分析显示：糖尿病小鼠肾脏CTMP mRNA的表达较正常对照组显著降低，而pYr-ads-4-CTMP质粒转染上调了CTMP mRNA的表达。另外， Western blot结果进一步证实了pYr-ads-4-CTMP质粒转染组小鼠肾脏CTMP蛋白的表达明显增加，较pYr-adshuttle-4空质粒组上调了8.84倍；同时 phospho-Akt(Ser473)蛋白的表达受到显著抑制，下降了60.00%(P<0.05)。同样地，免疫组化揭示了相似的结果，IPP软件分析IOD值显示：与pYr-adshuttle-4空质粒组相比，pYr-ads-4-CTMP质粒转染组小鼠肾脏CTMP蛋白的表达上调了9.43倍，同时伴随phospho-Akt(Ser473)的表达下降了54.33%。
　　进一步研究发现经尾静脉注射pYr-ads-4-CTMP质粒后，糖尿病小鼠肾脏TGF-β1及α-SMA蛋白的强阳性表达被显著抑制。Western blot半定量分析显示，pYr-ads-4-CTMP质粒转染组小鼠肾脏TGF-β1、α-SMA的蛋白表达水平与 pYr-adshuttle-4空质粒组相比分别下调了76.50%和24.37%。另外，Masson染色发现糖尿病组以及pYr-adshuttle-4空质粒组小鼠肾脏肾小管间质均出现了细胞外基质的沉积，而 pYr-ads-4-CTMP质粒转染组未观察到明显阳性信号。同时我们通过免疫组化进一步检测了各组小鼠肾脏ColⅢ、FN的表达，发现pYr-ads-4-CTMP质粒组小鼠肾小管上皮细胞间质中ColⅢ、FN的表达较pYr-adshuttle-4空质粒组分别降低了40.43%及51.47%。
　　结论：
　　1、糖尿病小鼠肾脏CTMP低表达同时伴随phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表达增加及细胞外基质的沉积。
　　2、高糖可诱导人肾小管上皮细胞 CTMP低表达同时伴随phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表达增加及ColⅠ、ColⅢ的分泌。
　　3、过表达的CTMP能够逆转高糖诱导的人肾小管上皮细胞CTMP低表达，并抑制phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1和α-SMA蛋白的表达以及ColⅠ、ColⅢ的分泌。
　　4、过表达的CTMP能抑制糖尿病小鼠肾脏Akt的磷酸化，下调TGF-β1、α-SMA蛋白的表达并减轻肾小管间质细胞外基质的沉积。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分CTMP/Akt在糖尿病小鼠肾脏中的表达以及与细胞外基质沉积的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分CTMP/Akt在高糖诱导的人肾小管上皮细胞内的表达以及与胶原分泌的关系

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分过表达CTMP对高糖诱导的人肾小管上皮细胞胶原分泌的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分过表达的CTMP对糖尿病小鼠肾脏细胞外基质沉积的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:信号通路与糖尿病肾病细胞外基质沉积

致谢

个人简历

一、一般情况

二、个人经历

三、博士研究生期间发表论文