局部应用伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵对去势大鼠股骨骨折愈合的影响

摘要

骨质疏松症是老年患者的一种常见疾病，老年骨质疏松性骨折多见于绝经后女性患者，其治疗常常由于患者骨量的减少，使得内固定物的治疗效果不甚理想，经常导致内固定的失败或者骨折不愈合。可以分为原发性和自发性骨质疏松,随着人口寿命的增加，原发性骨质疏松发生率在逐年增多。继发性骨质疏松包括内分泌疾病、肾脏疾病、药物、以及多发性骨髓瘤等。骨质疏松后很容易发生骨折，由于骨折早期骨组织的高转化率，再加上患肢不负重，很容易造成生成的骨痂发生分解代谢，使得骨折处原本并不多骨痂不能形成骨桥，造成骨折不愈合。骨折不愈合是其最常见的并发症之一,骨质疏松性骨折不愈合不仅导致劳动能力的丧失，给家庭和社会带来沉重的经济负担，同时由于中老年患者体质较弱，常常也会导致较高的死亡率。如何减少骨折不愈合的发生率，积极预防和治疗是关键。治疗措施包括药物治疗和骨移植等，手术治疗包括自体骨移植、同种异体骨移植、包含或者不包含合成因子的替代材料等；药物治疗包括能够影响骨质代谢的药物，如双膦酸盐、降钙素、甲状旁腺激素、钙制剂、胰岛素及其类似物等。
　　双膦酸盐作为一种骨吸收抑制剂，主要通过在骨折早期抑制破骨细胞向骨基质的吸附来改变骨吸收和骨形成的平衡；还可以通过影响纤维母细胞、成骨细胞和血管内皮细胞的迁移与分化来发挥作用。临床上主要分为含氮和不含氮两种，伊班膦酸钠（还包括阿仑膦酸钠、利塞膦酸钠等）属于前者，将第二代产品中氨基的氢取代以饱和烃链或咪唑环,使侧链长度达到最佳，进而使伊班膦酸钠有极强的抗骨质吸收能力。主要用于治疗恶性肿瘤以及骨代谢性疾病如骨质疏松或者骨质疏松相关疾病如椎间盘蜕变等、Paget病以及恶性肿瘤的高钙血症。伊班膦酸钠是目前吸收率最高的双膦酸盐药物，最直接的用药途径是静脉应用，但系统性用药常造成许多副作用包括胃肠道并发症、肌肉骨骼痛及颌骨坏死,近年来也有关于双膦酸盐导致非典型脆性骨折的报道，特别是口服阿仑膦酸钠的患者中出现股骨非典型脆性骨折。为了避免这些系统性并发症，我们局部应用伊班磷酸钠明胶海绵有效促进兔子的骨折愈合。局部用药可以作为双磷酸盐治疗骨质疏松性骨折不愈合的一个发展发向，主要报道集中在假体表面的应用。
　　胶原是一种主要的结构蛋白，肌腱中90％的细胞外蛋白，皮肤组织中50%都是胶原蛋白。它由3条多肽链组成，广泛分布于人体各组织器官中，以结缔组织含量最高，其中在骨科领域以Ⅰ型（真皮、肌腱、骨）、Ⅱ型胶原蛋白（透明软骨）的研究最为广泛。外源性胶原蛋白有着较好的生物学性能，如生物可降解性、细胞适应性、生物相容性、促进细胞增殖和加速血小板凝聚等，使其从众多生物材料中脱颖而出。本实验旨在研究在最佳剂量下，相比较系统给药，复合伊班膦酸钠的胶原蛋白能否有效促进去势大鼠骨质疏松性骨折的愈合，观察最终结果，从而指导临床上骨质疏松性骨折的治疗。
　　第一部分：去卵巢大鼠骨质疏松模型的建立
　　目的：确定大鼠骨质疏松模型是否成功建立，以判断其能否作为一个合格模型模拟绝经后妇女骨质疏松性骨折，从而探究骨质疏松性骨折的形成、治疗以及转归。
　　方法：选取132只雌性3月龄SD大鼠，适应环境一周后，其中模型组12只，6只沿耻骨联合上方1-1.5cm行腹侧正中纵切口行去势手术，正常饲养三个月，观察不同组别大鼠的基本状态，记录大鼠去卵巢后体重变化、卵巢组织病理学染色（HE染色）、骨密度等指标，来确认骨质疏松模型造模成功。通过应用QCT（量化CT）来明确股骨远端松质骨来确定骨密度变化，以均数±标准差的形式表示，所有标本均以同一方向放置。
　　结果：HE染色能清晰辨认卵巢组织中黄体以及卵泡的形成，确定卵巢切除成功。大鼠体重在去卵巢后，去卵巢组体重明显大于正常组(P<0.05)。QCT结果显示与对照组相比，去卵巢实验组术后三个月股骨远端松质骨骨密度显著降低(P<0.05)。
　　第二部分：神探讨不同剂量伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵局部应用胫骨骨膜反应实验
　　目的：针对抗吸收药伊班膦酸钠（双膦酸盐）的局部用药，探索不同剂量（低剂量、中剂量、高剂量）伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵植入于大鼠胫骨后，对胫骨骨膜损伤的刺激作用，确定用药的最佳剂量，从而指导下一步试验的进行
　　方法：取去雌性正常大鼠，正常饲养三个月后，手术刀刮胫骨中段，造成损伤，将大鼠平均分为5组（n=12）：假手术组（Sham）、胶原蛋白海绵组（CS）、小剂量伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组（SIB+CS，0.004 mg IB）、中剂量伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组（MIB+CS，0.04 mg IB）和大剂量伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组（LIB+CS，0.4mg IB），分别置入骨膜损伤处，正常观察两周后处死大鼠，通过影像学及组织病理学观测，明确破骨细胞受抑制情况，确定伊班膦酸钠的最佳用药剂量，为下一步实验做准备。
　　结果：在局部植入处有隆起，骨皮质明显增厚，骨干明显增粗，考虑为不成熟新生的网织骨，而尤以高剂量组最为明显；Trap染色显示破骨细胞抑制作用各有差异，破骨细胞数目在中剂量组最少，差异有统计学意义，中剂量组确定为最佳的给药浓度，对破骨细胞地抑制作用最强。针对抗吸收药伊班膦酸钠（双膦酸盐）的局部用药，我们将中剂量作为下一部分实验的选用标准。
　　第三部分：神局部应用伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵治疗去势大鼠股骨骨折
　　目的：针对抗吸收药伊班膦酸钠（双膦酸盐）的局部用药，探索局部应用伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵，对骨质疏松性股骨骨折愈合、重塑的作用。
　　方法：取去卵巢大鼠和正常大鼠，正常饲养三个月后，经外侧入路行右股骨开放骨折手术，给予克氏针固定，各组分别接受生理盐水和药物注射或局部应用，分为 Sham组、Control组、胶原蛋白海绵组（CS）、伊班膦酸钠组皮下注射（150μg/kg；CS+IB）、伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组（IB/CS）以胶原蛋白海绵为载体置入骨折局部，正常饲养三个月，分4周、12周处死，通过影像学、生物力学、MicroCT、组织病理学、血清学手段来对各组骨折愈合情况进行评估。
　　结果：去卵巢大鼠模型在4周时，骨折的愈合受到严重的影响，胶原蛋白与伊班膦酸钠均能不同程度的促进早期骨痂的生成。与骨质疏松对照组模型、系统性用药相比，局部用药组能够有效提高骨痂的含量、增加骨组织抗外力的能力。12周时，局部用药组的结构力学特性诸如弹性模量降低，但是骨组织的微结构指标诸如骨体积分数、骨小梁厚度以及骨小梁连接度等指标均较系统性给药组有上升。局部给药组可能药物能够更多的与暴露的骨表面相结合，也减少了药物在循环过程中的丢失，故其促进骨折愈合以及软骨内成骨的能力明显高于系统性用药组。对骨重塑的抑制作用，要强于系统性用药组，但是两者之间并不存在显著差异。4周时，CTX水平在IB治疗组尤其是局部用药组显著降低，12周时CTX水平CS+IB与CS/IB差异没有统计学意义；PINP水平则是在4周时CS、IB+CS、IB/CS较OVX组有升高均有不同程度升高，差异有统计学意义。12周时去卵巢大鼠PINP水平基本一致，均高于Sham组。
　　并通过影像学、生物力学、Micro-CT、病理学以及血清学研究证实，局部应用伊班膦酸钠能够有效提高早期骨痂的形成，骨组织的生物力学性能以及微结构。晚期对骨痂重塑的轻度抑制，不会导致骨组织抗外力特性下降，结构性生物力学性能仍然是提高的。
　　结论：
　　1.经过三个月的饲养，去卵巢大鼠骨质疏松模型造模成功，能够模拟绝经后妇女骨质疏松的高转化状态。
　　2.经过胫骨骨膜反应实验，证实中等剂量的伊班膦酸钠是最佳的促进骨折愈合的剂量。
　　3.局部应用伊班膦酸钠能够显著提高骨质疏松性骨折愈合的速度，防止骨折不愈合的发生。使得其临床应用成为可能。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分去卵巢大鼠的骨质疏松模型的建立

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分不同剂量伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵局部植入大鼠胫骨实验

前言

材料和方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分局部应用伊班膦酸钠复合胶原蛋白海绵治疗去势大鼠股骨骨折

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:骨质疏松性骨折的药物治疗

致谢

个人简历