C反应蛋白加重心肌缺血再灌注损伤的机制研究及他汀的心肌保护作用

摘要

近年来心绞痛、急性心肌梗死等缺血性心脏病（ischemic heart disease）的发病率居高不下。溶栓、早期经皮冠状动脉介入治疗（ percutaneous coronary intervention;PCI）等方法的广泛应用;使缺血的心脏能够在短时间内重新获得血液灌注并恢复氧供;从而有利于病情的好转；然而再灌注有时反而会加重心脏的结构及功能障碍;这种现象称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury;MIRI）;临床中可表现为恶性心律失常、心功能不全甚至猝死等情况;严重危害患者健康。因此; MIRI 一直是心血管医疗工作者关注的焦点话题之一。如何使再灌注治疗在尽早恢复缺血冠脉血流的同时;尽可能地减少再灌注损伤;已经成为了冠心病;特别是急性心肌梗死治疗中亟待解决的关键问题。MIRI 是多种因素共同参与的复杂过程;线粒体膜通透性改变、钙超载或钙再分布、氧自由基生成、补体系统激活等机制是形成MIRI的重要原因。其中;线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore ; mPTP）与ATP敏感性钾通道（ATP sensitive potassium channel;KATP）均与缺血再灌注这一过程紧密相连。KATP通道主要分为细胞膜KATP（sarcolemmal KATP）通道和线粒体KATP（mitochondrial KATP;mitoKATP）通道。mPTP开放导致的线粒体膜通透性改变是缺血再灌注时各种损伤的汇聚点;而mitoKATP通道的开放则可以通过逆转钙超载、稳定细胞膜等机制减少 MIRI;发挥心肌保护作用；并且 mitoKATP通道的开放可以抑制 mPTP 开放;从而阻断mPTP下游凋亡蛋白酶激活的级联反应;抑制心肌细胞凋亡。 C反应蛋白（C-reactive protein;CRP）是最先发现的一种急性时相蛋白;由于其能在钙离子存在时与肺炎球菌C型多糖发生沉淀反应而得名。生理条件下体内的CRP含量非常低;当出现急性炎症或组织损伤时;CRP浓度急剧升高;因此 CRP最早主要用于检测和评估急性损伤与炎症的发展程度。上世纪80年代;有研究发现CRP增高可以预测未来发生冠状动脉事件的几率;从而引起了广大医生特别是心血管内科医生的高度关注。随后;许多大型流行病学调查及实验研究支持 CRP成为动脉粥样硬化、冠心病以及缺血性脑卒中等心脑血管疾病发生、发展强有力的预测因子。不仅如此;越来越多的研究表明;CRP 可能直接参与了动脉粥样硬化的形成、发展和演变以及缺血再灌注损伤的过程。然而;CRP 作为干预因子;对心肌缺血再灌注这一过程的影响至今少有研究;其发生机制尚不完全清楚。此外;如前所述;mPTP与mitoKATP通道是缺血再灌注发生过程中的两个重要的相关作用位点。mitoKATP开放剂二氮嗪(diazoxide)与mPTP阻断剂环孢菌素A(cyclosporin A; CsA)均可以减少MIRI的发生;而CRP与缺血再灌注时mitoKATP、mPTP的关系目前尚不知晓。通过对上述问题的研究;有可能为日后减少心肌缺血再灌注损伤的发生提供新的治疗靶点;从而使更多的患者从再灌注治疗中获益。 其次;细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase; ERK)、Jun N端激酶／应激活化的蛋白激酶(Jun N-terminal kinase／Stress Activated Protein Kinase; JNK/SAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氛酸-苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidyl Inositol 3-kinase/serine-threonine kinase; P13K/Akt)通路是机体内重要的信号传导通路;均与缺血再灌注这一过程紧密相关。发生心肌缺血再灌注损伤时 CRP 对上述通路有何种影响的相关报道尚少。通过对此问题的研究;可以帮助我们较为深入地探讨 CRP 影响心肌缺血再灌注损伤的作用机制;以便为减少缺血再灌注损伤提供充分的理论基础。 另外;他汀类药物在冠心病的治疗中占据重要地位;其除了具有降低血脂的作用以外;还可以发挥独立于降脂作用之外的效应;如抑制炎症反应、改善内皮功能、稳定动脉粥样斑块等。缺血再灌注损伤与他汀多效性均为本课题组多年来的研究领域。证据表明;病理水平的CRP 能够直接参与动脉粥样硬化的进程;我们预测 CRP亦可能会促进心肌缺血再灌注损伤的发生;如果此结论被证实;则降低 CRP水平即可减少缺血再灌注损伤;因而能够为减少缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。虽然目前尚无CRP 特异性阻断剂广泛应用于临床;但已有一些相关的基础研究与临床研究显示;阿司匹林、他汀等药物均可以降低CRP水平。如JUPITER 大型临床研究表明;对于 CRP水平升高的患者;使用他汀类药物能够在大幅降低低密度脂蛋白的同时显著降低 CRP水平;从而减少心血管事件的发生。我们课题组在前期研究中发现;他汀类药物能够通过活化mitoKATP通道、减少活性氧生成和钙超载;进而抑制mPTP的开放等机制减轻心肌缺血再灌注损伤。本课题亦将探讨阿托伐他汀（atorvastatin;Ator）对CRP参与后的心肌缺血再灌注损伤如何发挥心肌保护作用。 为此;我们拟应用SD新生乳鼠原代培养心肌细胞建立体外氧糖剥夺再灌注模型;通过比较发生缺血再灌注时有无 CRP干预后心肌细胞活力及乳酸脱氢酶（LDH）活性水平等指标的变化;明确CRP对心肌缺血再灌注损伤的影响。同时;通过对氧糖剥夺再灌注时加用 mitoKATP通道开放剂二氮嗪或mPTP阻断剂环孢菌素A后心肌细胞mPTP开放程度、线粒体膜电位水平等指标的变化;了解CRP与mitoKATP及mPTP的关系;并探讨CRP对相关信号通路的影响机制;从而为早日研究出CRP特异性阻断剂提供研究基础。此外;通过观察在 CRP干预的基础上加用阿托伐他汀共同处理后上述指标的变化;明确他汀类药物对 CRP介导的心肌缺血再灌注损伤能否发挥同样的心肌保护作用;从而在临床工作中为高CRP人群减少缺血再灌注损伤的治疗方案提供更为充足的理论依据。 第一部分 C反应蛋白对SD大鼠原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注的影响 目的：研究作为刺激因子的 C 反应蛋白能否加重模拟体内缺血再灌注损伤过程的原代培养心肌细胞的氧糖剥夺再灌注损伤。 方法：选择出生1-2天的SD大鼠;通过建立氧糖剥夺再灌注损伤模型模拟体内的心肌缺血再灌注损伤;心肌细胞进行氧糖剥夺 3h;再灌注1h。 CRP使用浓度的确定： 以往的研究中使用的 C 反应蛋白浓度通常在 5μg/mL至 50μg/mL之间。因此;我们测试了不同CRP作用浓度对缺血再灌注的影响。通过MTS测定表明;在氧糖剥夺前给予10ug/mL的CRP进行预处理;即可以明显加重心肌缺血再灌注损伤。 新生SD大鼠原代培养的心肌细胞随机分组如下： 1. control组：使用含 10% FBS的DMEM高糖培养基; 在37℃、5%CO2培养箱中培养的原代心肌细胞。 2. OGD/R组：给予氧糖剥夺3h;再灌注1h。 3. CRP + OGD/R组：先向细胞培养液中加入10μg/mL的CRP孵育24h;再进行OGD/R。 进行 OGD/R 后;通过 MTS 检测细胞活力;通过比色测定法测定细胞培养液中 LDH 漏出率;以了解心肌受损程度。采用钙黄绿素-AM （calcein/AM）和氯化钴（CoCl2）共同孵育法及激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy;LSCM）技术;测定各指标干预下的mPTP开放程度；采用四甲基罗丹明乙酯Tetramethylrhodamine ethylester (TMRE)孵育法及LSCM技术测定线粒体膜电位水平的变化。 结果： 1. CRP干预对氧糖剥夺再灌注时心肌细胞活力的影响 通过MTS检测心肌细胞活力;每个组别以所测结果与control组相比的百分数表示。经过 OGD/R 处理后;心肌细胞活力可下降至 82.36% ± 6.18%(P=0.0031)。此外;与OGD/R组相比;CRP预处理组可进一步显著降低心肌细胞活力;达到了对照组的64.84%±4.06%(P=0.0007)。 2. CRP干预对心肌细胞LDH水平的影响 与control组比较;OGD/R组心肌细胞上清液中的 LDH水平明显上升（95.10 U/L±21.57 U/L versus 145.30 U/L±16.06 U/L;P=0.0319）。而给予CRP预处理后;LDH数值进一步升高（208.20 U/L±19.23 U/L）; 其差异也具有统计学意义 （P=0.0122）。 3. CRP干预对mPTP开放程度的影响 每组以所测结果与control组相比的百分数表示。与control组相比; OGD/R组心肌细胞绿色荧光强度明显减弱（60.93%±2.82%;P<0.0001）。给予 CRP 干预的 OGD/R 组的荧光强度则进一步显著下降（33.08%±3.48%;P<0.0001）。 4. CRP干预对线粒体膜电位的影响 每组以所测结果与control组相比的百分数表示。OGD/R组心肌细胞红色荧光强度（57.26%±2.95%）明显低于control组;其差异具有统计学意义（P<0.0001）。而给予 CRP 干预后;其荧光强度进一步显著减弱（33.31%±2.03%;P<0.0001）。 结论： 1. CRP的干预明显降低了OGD/R后的心肌细胞活力。 2. CRP的干预增加了OGD/R后细胞培养液中的LDH水平。 3. CRP的干预使OGD/R时mPTP开放程度增加。 4. CRP的干预明显降低了OGD/R时的线粒体膜电位水平。 5. CRP加重了心肌细胞的氧糖剥夺再灌注损伤。 第二部分 C反应蛋白与氧糖剥夺再灌注损伤发生时mitoKATP、mPTP通道的关系及对信号通路的影响 目的：探讨CRP与发生心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤时mitoKATP、mPTP 通道的关系;并探讨 CRP 对于心肌细胞氧糖剥夺再灌注相关信号通路的影响;即了解CRP加重心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的可能机制。 方法： 从新生SD大鼠分离并培养原代心肌细胞;建立氧糖剥夺再灌注模型。心肌细胞进行氧糖剥夺3h;再灌注1h。 新生大鼠心肌细胞随机分组如下： 1. control组：使用含 10% FBS的DMEM高糖培养基; 在37℃、5%CO2培养箱中培养的原代心肌细胞。 2. OGD/R组：给予氧糖剥夺3h;再灌注1h。 3. CRP + OGD/R组：先向细胞培养液中加入10μg/mL的CRP孵育24h;再进行OGD/R。 4. CRP+CsA+OGD/R组：培养的心肌细胞先与10μg/mL 的CRP共同孵育24h;然后进行3h的OGD。在再灌注开始时;加入10μM的环孢菌素A与心肌细胞孵育20min;继续再灌注共1h。 5. CRP + Diazoxide + OGD/R组: 培养的心肌细胞先与10μg/mL的CRP 共同孵育 24h;在进行 OGD/R 前;加入 100μM 的二氮嗪共同孵育90分钟;再进行OGD/R。 进行 OGD/R 后;通过 MTS 检测细胞活力;通过比色测定法测定细胞培养液中LDH漏出率;以了解心肌受损程度。采用calcein/AM和CoCl2共同孵育法及 LSCM 技术;测定各指标干

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