花粉细胞内游离钙离子的荧光探针--激光共聚焦法的测定

摘要

该实验以低温保存的兰州百合花粉为试验材料,首先摸索出了花粉原生质体的大量游离和纯化方法,原生质体产率达到30-50﹪左右,经纯化原生质体的纯度能够达到95﹪以上.经FDA检测证实,所得原生质体、完整花粉粒和花粉管为材料对酯化形式钙离子特异性荧光指示剂装载(loading)进入细胞的方法进行了研究,观察到在细胞质膜活化剂Pluronic F-127的辅助作用下,经常温(25℃)孵育可以使酯化形式的钙离子荧光指示剂进入到细胞内部.在荧光显微镜下可以看到细胞发出的明亮荧光;其中花粉原生质体的荧光强度明显大于完整花粉粒和花粉管的荧光强度,表明原生质体的钙离子荧光指示剂装载量明显大于另两种材料的装载量.采用激光共聚焦显微镜技术,进一步证实荧光指示剂的确已经装载到了细胞内部.对花粉原生质体和完整花粉粒细胞质的荧光分布的研究结果显示,钙离子在细胞质中是呈极性分布的,在近萌发孔区域钙离子的分布比较多,而在其他区域钙离子则较少;细胞核与细胞周缘区域钙离子浓度比细胞质的浓度低.其中,原生质体的细胞质钙离子极性大于完整花粉粒的极性.对原生质体细胞钙离子动态变化的研究初步结果显示,胞外钙调素可能对细胞质钙离子的浓度和动态有影响.

目录

缩写词

文献综述

1.植物花粉原生质体制备研究概况

2.细胞内钙离子测定概况

2.1钙离子的生理功能及测定细胞内钙离子水平的意义

2.2.细胞内钙离子水平的测定方法现状

引言

材料和方法

1.材料和试剂

2.实验方法

2.1.药品配制

2.2.百合花粉原生质体制备

2.3.Ca2+荧光指示剂的装载及荧光显微镜检测

2.4.细胞质内Ca2+分布的LSCM扫描测定

2.5.花粉原生质体细胞内Ca2+动态测定

结果及分析

1.百合花粉原生质体的制备

1.1.花粉活性的检测

1.2.花粉的酶解

1.3.原生质体去壁情况检测

1.4.原生质体的纯化

1.5.纯化原生质体的活性检测

2.Ca2+荧光指示剂的装载及荧光显微镜检测

2.1纯化原生质体的指示剂装载

2.2.花粉粒的Fluo-3 AM装载

2.3.花粉管的Fluo-3 AM装载

3.装载上Fluo-3 AM细胞的LSCM扫描测定

3.1.花粉原生质体的扫描测定

3.2.花粉粒的扫描测定

3.3.花粉管的扫描测定

4.原生质体细胞质Ca2+动态变化

4.1.细胞质钙离子动态点扫描：

4.2.细胞质钙离子动态的面扫描记录：

讨论

参考文献

结论

致谢