异三聚体G蛋白和ROS在细胞外ATP调控拟南芥气孔运动中的作用

摘要

气孔运动是植物体内水分代谢调控的重要过程，气孔运动的调节机理是植物生理学研究的重要内容。细胞外ATP(extracellular ATP，eATP)在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要的调节作用，是植物细胞外重要的信使分子。本文研究了eATP对气孔运动的影响及其可能的信号转导机制。 本文采用拟南芥野生型材料、异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体和超表达株系、ROS(reactive oxygen species)合成的关键酶-NADPH氧化酶的基因缺失突变体、以及三磷酸腺苷双磷酸酶催化亚基基因的缺失突变体为材料，采用表皮条生物分析、激光共聚焦显微技术、RT-PCR等实验方法对异三聚体G蛋白和ROS在eATP调节气孔运动的信号转导过程中发挥的作用进行了研究。结果表明： 拟南芥野生型经eATP处理后，气孔开度明显增大，且随着eATP浓度的升高，气孔开放所受促进程度加大；不可水解的ATP结构类似物(BzATP，ATPγS，2meATP)同样能够诱导气孔开放，ADP和GTP也能不同程度地促进气孔开放，而AMP和腺苷则无明显作用，表明细胞外ATP能够作为信使分子促进气孔开放。三磷酸腺苷双磷酸酶和葡萄糖-已糖激酶处理后，气孔开度明显减小，在自然光照下，三磷酸腺苷双磷酸酶催化亚基基因缺失突变体比野生型的气孔开度大，说明了内源eATP在气孔运动中同样起着正调控作用。 eATP处理后，异三聚体G蛋白α亚基基因超表达株系气孔开度变大，而异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体的气孔开度变化不明显，表明异三聚体G蛋白可能参与了eATP促进气孔开放的信号转导过程。 叶片经外源ROS处理后，发现低浓度的ROS能促进气孔开放，而高浓度ROS促进气孔关闭；在eATP处理的同时加入细胞质膜NADPH氧化酶专一性抑制剂二亚苯基碘和还原剂二硫苏糖醇以抑制或清除细胞产生的活性氧基团，eATP不能促进气孔开放；NADPH氧化酶的基因缺失突变体经eATP处理后，气孔开度变化不明显。上述结果表明NADPH氧化酶参与的ROS形成在eATP诱导拟南芥气孔开放的过程中起着重要的作用，是eATP信号途径中必不可少的成员。 利用ROS荧光染料H2DCFDA，结合激光共聚焦技术检测结果显示，eATP处理后保卫细胞内ROS含量明显升高，在NADPH氧化酶基因缺失突变体中eATP不能诱导ROS水平升高；异三聚体G蛋白α亚基基因缺失突变体大大削弱了eATP诱导保卫细胞内ROS升高的过程，而超表达株系加速了eATP诱导保卫细胞内ROS升高的过程。表明异三聚体G蛋白介导了eATP诱导胞内ROS升高的过程。 上述结果显示，eATP能够作为信号分子促进拟南芥气孔开放，异三聚体G蛋白和ROS在此过程中发挥重要介导作用。

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论文说明：缩略词表

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引 言

一文献综述

1.ATP信号研究进展

1.1动物细胞外ATP的生理功能和信号转导机制

1.2植物细胞外ATP的生理作用及其信号转导

2气孔运动中的信号研究进展

2.1保卫细胞中异三聚体G蛋白介导的信号转导途径

2.2气孔运动中的ROS信号

2.3钙信使在气孔运动中的作用

3 植物异三聚体G蛋白研究进展

3.1 G蛋白的种类

3.2异三聚体G蛋白的结构及活化机制

3.3植物异三聚体G蛋白信号组分

3.4异三聚体G蛋白各信号组分在植物细胞信号转导中的作用

4活性氧信号研究进展

4.1 活性氧的种类和特性

4.2植物体内活性氧的产生

4.3植物体内活性氧的清除

4.4植物体内活性氧信号转导及其调控

二材料和方法

1 实验材料

2试剂

3 实验方法

3.1拟南芥种植方法

3.2表皮条生物分析

3.3拟南芥保卫细胞胞内钙离子浓度变化的测定

3.4激光共聚焦显微技术(CLSM)测定保卫细胞内ROS的变化

3.5 RNA的提取及半定量检测基因转录本的表达

3.6 引物合成

3.7转aequorin基因全过程

三结果与分析

1.实验所用突变体材料的遗传背景鉴定

1.1wGα、cGα的RT-PCR鉴定

1.2 gpα1-1、gpα1-2突变体的PCR鉴定

1.3 atrbohD/F突变体的PCR鉴定

2.细胞外ATP在气孔运动过程中的作用

2.1 细胞外ATP对拟南芥气孔运动的影响

2.2细胞外ATP对不同生态型拟南芥气孔运动的影响

2.3不同形式eATP对气孔运动的影响

2.4ATP结构类似物对气孔运动的影响

2.5腺苷三磷酸结构完整性及不同结构核苷磷酸分子对气孔开度的影响

2.6 内源eATP在气孔运动中的作用

3 异三聚体G蛋白α亚基介导细胞外ATP诱导气孔开放的过程

4 ROS对气孔运动的影响

4.1 不同浓度ROS(氯化铜+抗坏血酸)对气孔运动的影响

4.2 ROS在细胞外ATP诱导气孔开放过程中的作用

4.3 DPI和DTT在细胞外ATP诱导气孔开放中的作用

4.4AtrbohD、AtrbohF参与eATP诱导气孔开放的过程

4.5细胞外ATP促进保卫细胞ROS升高

4.6 NADPH氧化酶参与细胞外ATP诱导保卫细胞ROS产生的过程

5异三聚体G蛋白α亚基对eATP诱导保卫细胞内ROS升高过程影响

6 aequorin基因的克隆及其在拟南芥中的转化

6.1 拟南芥aequorin基因PCR结果

6.2拟南芥aequorin基因的克隆和序列分析

6.3拟南芥aequorin基因植物表达载体的构建

6.4拟南芥转基因植株的获得

6.5转基因植株的PCR鉴定

7细胞外ATP对拟南芥叶片细胞内钙离子浓度的影响

7.1 eATP对拟南芥Col叶片细胞内钙离子浓度的影响

7.2 eATP异三聚体G蛋白相关突变体叶片细胞内钙离子浓度的影响

四讨论与结论

1细胞外ATP诱导拟南芥气孔开放

2 Gα参与细胞外ATP诱导气孔开放的过程

3 ROS参与eATP诱导气孔开放的过程

4 Gα可能参与细胞外ATP诱导胞内ROS升高的过程

5 eATP对细胞内Ca2+浓度的影响

参考文献

致谢

攻读学位期间论文及论著发表