群体感应对铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸合成的调控

摘要

群体感应(Quorum-sensing，QS)是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种调节机制。铜绿假单胞菌中N-acylhomoserine lactone(AHL)类信号分子介导QS系统由lasI和rhlI合成的信号分子3-氧代十二烷酰高丝氨酸内酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，3OC12-HSL)和N-丁酰高丝氨酸内酯(N-(butanoyl)-L-homoserine lactone，C4-HSL)以及各自的受体蛋白lasR、rhlR组成，它们以级联方式调控多个基因表达。
　　 聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)，是一类由多种微生物在碳、氮营养失衡的条件下作为碳源和能源贮存而合成的热塑性和生物降解性较理想的生物高聚物。Sun等研究发现调控系统信号分子的受体LuxR是哈氏弧菌合成PHB所必须的，初步表明细菌QS参与胞内PHA的合成。随后关于这方面的研究较少，目前文献报道只能间接的表明QS参与PHA的调控，因此，根据相关文献报道，我们以铜绿假单胞菌为材料，进一步研究QS系统与菌体合成PHA的关系。
　　 本文利用铜绿假单胞菌PAO1及其QS突变株通过气相色谱、荧光定量PCR在生理和分子水平研究QS对聚羟基脂肪酸酯的调控。同时构建pphaC1：lacZ的转录融合结构，将含有该结构的报告载体转录铜绿假单胞菌PAO1及其lasI突变株中，检测QS缺失基因对phaC1转录水平的调控作用。为进一步确认PHA的生物合成是受QS系统调控，我们将含有lasI/lasR基因的穿梭载体分别导入QS突变株PAO55、PAO56。结果显示：1)铜绿假单胞菌PAO1中C4-HSL合成酶基因rhlI缺失突变株PAO210胞内PHA积累量与野生型无差别；而3OC12-HSL合成酶基因lasI缺失突变株PAO55、3OC12-HSL受体合成酶基因lasR缺失突变株PAO56以及lasI/lasR双缺失突变株PAO57胞内PHA含量与野生型相比明显减少；2)lasI和lasR的突变株体内PHA合成酶基因phaC1的表达量显著降低，信号分子3OC12-HSL回补实验使phaC1的表达量可恢复到野生株水平，但只可部分恢复lasI缺失导致的胞内PHA合成。3)通过对含有pphaC1：lacZ的转录融合结构PAO2和QS突变株PAO552菌株中β-半乳糖苷酶酶活性的检测，发现PAO552中β-半乳糖苷酶酶活明显低于野生型，表明在lasI基因缺失后，phaC1转录水平与野生型相比明显降低，间接说明QS对phaC1基因的转录具有正调控作用。4)通过基因回复，发现lasI/lasR基因互补突变株PAO551、PAO562胞内PHA含量可部分恢复，但未达到到野生株水平。
　　 由此推测，铜绿假单胞菌群体感应系统中QS系统参与胞内聚羟基脂肪酸脂酯合成的调控。

目录

文摘

英文文摘

引言

1 文献综述

1.1 群体感应系统

1.1.1 铜绿假单胞菌群体感应系统

1.1.2 N-acylhomoserine lactone(AHL)类信号分子介导群体感应系统

1.1.32-alkyl-4-quinolone(AQ)类信号分子介导群体感应系统

1.1.4 群体感应系统信号分子的检测方法

1.2 聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate,PHA)简介

1.2.1 聚羟基脂肪酸酯单体的组成和分类

1.2.2 聚羟基脂肪酸酯相关基因和酶

1.2.3 聚羟基脂肪酸酯合成途径

1.2.4 聚羟基脂肪酸酯鉴定及检测

1.2.5 聚羟基脂肪酸酯应用

1.2.6 聚羟基脂肪酸酯展望

1.3 课题研究的目的和意义

2 QS系统与胞内PHA合成的表型分析

2.1 材料

2.1.1 供试菌株及载体

2.1.2 主要试剂

2.1.3 仪器设备

2.1.4 培养基

2.2 方法

2.2.1 培养条件

2.2.2 PHA标准曲线的绘制

2.2.3 气相色谱(GC)对PHA含量检测

2.2.4 不同时间对PHA合成的影响

2.2.5 信号分子提取

2.3 结果

2.3.1 PHA标样气相色谱分析

2.3.2 表型分析

2.3.3 信号分子检测

2.4 小结

3 QS系统与胞内PHA合成关系的分子水平分析

3.1 材料

3.1.1 供试菌株及载体

3.1.2 主要试剂

3.1.3 仪器设备

3.1.4 培养基

3.1.5 溶液配制

3.2 方法

3.2.1 细菌RNA提取

3.2.2 去除RNA中的DNA

3.2.3 进行Realtime-PCR

3.2.4 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备

3.2.5 大肠杆菌的热激转化

3.2.6 CTAB法提取质粒DNA

3.3.7 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

3.2.8 铜绿假单胞菌转录报告载体的构建的构建

3.2.9 β-半乳糖苷酶(1acZ)酶活测定

3.3 结果

3.3.1 realtime PCR检测

3.3.2 转录报告载体的构建

3.3.3 铜绿假单胞菌的抗性筛选

3.3.4 β-半乳糖苷酶活性的检测

3.4 小结

4 构建铜绿假单胞菌回复菌株

4.1 材料

4.1.1 菌株、质粒和培养时间

4.1.2 主要试剂

4.1.3 仪器设备

4.1.4 溶液配制

4.1.5 培养基

4.2 方法

4.2.1 培养条件

4.2.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备

4.2.3 大肠杆菌的热激转化

4.2.4 CTAB法提取质粒DNA

4.2.6 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

4.2.7 铜绿假单胞菌表达载体的构建

4.2.8 铜绿假单胞菌感受态细胞的制备

4.2.9 铜绿假单胞菌电击转化

4.2.10 铜绿假单胞菌的抗性筛选

4.2.11 应用气相色谱(GC)对PHA含量进行检测

4.3 结果

4.3.1 铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA的提取

4.3.2 铜绿假单胞菌表达载体p415G-las1的构建

4.3.4 铜绿假单胞菌表达载体p415G-lasR的构建

4.3.5 回复菌株的构建

4.3.6 表型分析

4.4 小结

讨 论

结 论

参考文献

后 记(含致谢)

攻读学位期间取得的科研成果