崇安湍蛙皮肤组织抗菌肽的分离纯化、鉴定、cDNA克隆与功能分析

摘要

无尾两栖类中的湍蛙属目前包括45个种,其中19种广泛分布于中国的热带和亚热带地区。崇安湍蛙作为湍蛙属中一个较为常见种,广泛分布于中国西部和南部山区。
　　本研究以崇安湍蛙(Amolops chunganensis)为材料,应用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)结合高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)从崇安湍蛙皮肤分泌物中鉴定出4条抗菌肽。同时构建了崇安湍蛙皮肤组织cDNA文库,并从此文库中成功克隆到5条抗菌肽cDNA编码序列,这5条cDNA序列可推导出5条不同的抗菌肽前体,这些抗菌肽前体可释放5条不同的成熟抗菌肽,其中4条与皮肤分泌物中鉴定到的多肽相吻合。根据其结构特点不同,分别命名为temporin-CG1(FLPFVGNLLKGLL-NH2)、temporin-CG2(FFPIVGKLLSGLF-NH2)、temporin-CG3(FLPIVGKLLSGLF-NH2)、esculentin-2CG1(SLFSIFKTAAKFVGKNLLKQ,AGKAGLETLACKAKNEC)和palustrin-2CG1(GLWNTIKEAGKKFAINVLDKIRCGIAGGCKT)。本实验对这5种抗菌肽的抗菌谱和抗菌能力进行了检测,同时对其溶血活性进行了测定。结果表明这5种抗菌肽都具有广谱抗菌性,对哺乳动物红细胞的溶血活性普遍较低。通过扫描电子显微镜观察了它们作用于细菌细胞后,细菌细胞所产生的变化,初步研究了其抗菌机理。