长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因克隆、原核表达及功能分析

摘要

长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）是专性吸血的体外寄生虫，在自然界中存在两性生殖种群与孤雌生殖种群，可携带多种病原体而导致疾病，给人类健康和畜牧业生产带来极大危害。防御素(defensin)是一种抗微生物肽，在动植物中广泛存在，尤其在节肢动物中，由于缺乏适应性免疫反应，防御素在其先天免疫防御过程中发挥重要作用，可以有效对抗入侵的病原体。蜱作为专性吸血的特殊类群，同样具有防御素家族多肽以抵御微生物或病原体的侵袭。
　　本研究以长角血蜱孤雌生殖种群为研究对象，利用Clontech建库试剂盒和3'RACE的方法构建cDNA文库，分子克隆得到三条防御素基因，分别命名为Hp-defensin-1、Hp-defensin-2和Hp-defensin-3。开放阅读框大小分别为225bp、210bp和237bp，编码氨基酸个数为74、69和78，成熟肽长度分别为38、37和46，等电点分别为9.69、8.33和9.50。通过对Hp-defensin-1进行原核表达及功能分析，结果表明，长角血蜱Hp-defensin-1与边缘革蜱(ACJ04433.1)同源性最高，为75.68％。系统发育树表明，Hp-defensin-1基因序列与革蜱属（森林革蜱KJ885301.1）亲缘关系最近。荧光定量结果表明，Hp-defensin-1表达量在不同时期和不同组织存在显著性差异(P＜0.05)，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌胁迫效果依次减弱。将Hp-defensin-1连入载体pET-32(a+)，并转入BL21中表达，表达产物经SDS-PAGE电泳显示目的蛋白大小约23kDa，与预测大小一致。该多肽对革兰氏阳性菌具有广谱抗菌性，对部分革兰氏阴性菌和真菌也具有一定的抗菌活性。表达产物的抗氧化实验表明，该多肽对ABTS·+和DPPH·自由基具有很强的清除能力，具有很强的抗氧化活性，但不存在溶血活性，因此对健康的人血细胞无伤害，为新型抗菌药物的研发提供了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 孤雌生殖种群简介

1．3 抗菌肽简介

1．4 昆虫抗菌肽简介

1．5 展望

第二章 长角血蜱孤雌种群防御素基因的分子克隆

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验试剂及耗材

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 长角血蜱孤雌生殖种群总RNA的提取

2．2．2 cDNA文库的构建

2．2．3 抗菌肽基因的克隆

2．2．4 抗茵肽基因的全长的扩增

2．3 实验结果

2．3．1 长角血蜱孤雌生殖种群总RNA的提取

2．3．2 cDNA文库的构建

2．3．3 抗菌肽基因的克隆

2．3．4 抗菌肽基因的生物信息学分析

2．4 讨论

2．4．1 抗菌肽基因的克隆

2．4．2 抗菌肽的生物学分析

第三章 长角血蜱孤雌种群防御素基因的原核表达

3．1 实验材料

3．1．1 实验试剂及耗材

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 构建Defensin基因的原核表达载体

3．2．2 重组质粒pET-32(a+)-defensin的诱导表达

3．2．3 重组蛋白的质谱鉴定

3．2．4 重组蛋白诱导表达的条件优化

3．2．5 重组蛋白的纯化

3．3 实验结果

3．3．1 构建Defensin基因的原核表达载体

3．3．2 重组质粒pET-32(a+)-defensin的诱导表达

3．3．3 重组蛋白诱导表达的条件优化

3．3．4 重组蛋白的纯化

3．4 讨论

3．4．1 原核表达载体的选择与构建

3．4．2 蛋白诱导表达条件的优化与纯化

第四章 长角血蜱孤雌种群防御素的功能分析

4．1 实验材料

4．1．1 实验试剂及耗材

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因表达量的分析

4．2．2 抑菌活性的分析

4．2．3 抗氧化的分析

4．2．4 溶血活性的分析

4．3 实验结果

4．3．1 长角血蜱孤雌生殖种群防御素基因表达量的分析

4．3．2 抑菌活性的分析

4．3．3 抗氧化的分析

4．3．4 溶血活性的分析

4．4 讨论

4．4．1 防御素基因的定量分析

4．4．2 HP-defensin-1重组蛋白的功能分析

参考文献

致谢

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