牛病毒性腹泻-粘膜病病毒的分离、RT-PCR鉴定、NS2-3区基因克隆及变异分析

摘要

采取疑似牛病毒性腹泻-粘膜病的流产奶牛粪便及血凝块，处理后接种MDBK细胞，获得一株病毒。该分离毒能在MDBK细胞上形成有规律的病变，其病变效应与BVDV标准毒株相同。用双抗体夹心ELISA方法检验其余未发现病变的细胞培养物，结果均为阴性，没有分离出NCP型BVD毒株。 以牛病毒性腹泻病毒OregonC24V毒株全基因为模板，选择BVDVNS2-3基因重要区设计合成引物，对分离毒进行RT-PCR扩增，得到一条长约为665bp的片段。该分离毒基因组中无插入序列。 将此分离毒回归2月龄健康犊牛，接毒25天后扑杀剖检。犊牛表现为典型的急性病毒性腹泻症状和病变。采取脾、骨髓、肠淋巴结及血液接种MDBK细胞，细胞病变出现时间缩短，程度加剧。将此细胞毒进行RT-PCR检测，扩增出相应的665bp的片段，指示动物回归试验成功。 将PCR的扩增产物克隆到pMD18载体上，构建重组克隆质粒pMD18-T/NS2-3并转化入JM109工程菌，筛选后对重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定。结果表明，得到的阳性重组子中含有NS2-3基因重要区基因，且是正确插入到载体中的。对克隆片段进行测序，并与其它已发表的BVDV毒株进行比较，进行同源性分析。结果表明，此次分离的野毒株NS2-3重要区核苷酸序列与79.8﹪～100﹪，推导的氨基酸序列与OregonC24V、ILLC、Osloss、VEDEVAC株同源性为83.2﹪～100﹪。由于该毒株与VEDEVAC株核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性均为100﹪，命名此野毒株为VEDEVAC-Like(HB)，属于BVDVIb基因亚型。

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1引言

2材料与方法

3结果

4讨论

5结论

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