水稻根cDNA文库中抗菌蛋白/肽编码基因的筛选研究

摘要

作为防御系统的一部分，生物(包括植物)产生各种化合物来防御病原物的入侵。这些化合物包括蛋白和肽。鉴别并了解这些化合物及其在防御反应中的作用将可以更好的研究生物抗病的机理。 然而，目前发现这些肽和蛋白及其编码基因的方法非常繁琐，包括蛋白提取、纯化、生物实验和基因克隆等，从而限制了新的编码抗菌肽/蛋白(AMP)的基因发现。 本研究以微孔滤膜为支持介质，以菌体染色为鉴别手段，从cDNA文库中筛选可能编码抗菌肽的基因，克隆基因后进行蛋白质的体外表达，进而开展抗菌活性的鉴定。从水稻根cDNA表达文库的约3×104个克隆出发，初筛得到了300多个候选克隆，进一步经过固体涂板验证、液体抑菌活性测定，确定其中57个为进一步验证的阳性克隆。将这些阳性克隆提取质粒，分别转化到大肠杆菌菌株XL1-Blue、DH5ct、BL21(DE3)pLysS、ER2566中进行抗菌活性鉴定，根据对不同细菌菌株的抗性，可将这些克隆分为四类：第1类是四种菌中染色都为蓝色的克隆；第1I类是三种菌中染色为蓝色的克隆，依此类推。对阳性克隆进行5’端测序，然后进行BlastX分析，结果表明有些序列编码已知的抗菌肽，如脂转移蛋白；有些序列编码抗性相关蛋白，如LEA蛋白；有些序列编码的蛋白与细菌自身蛋白相似，可能对细菌的正常生理功能有干扰作用；此外，我们还筛选获得了一些功能未知的克隆。 为了进一步鉴定这些克隆的功能，我们对部分筛选到的蛋白质编码基因克隆到了高表达载体pET32a、pET28a和pETlla中，主要结果如下： (1)将脂转移蛋白编码基因亚克隆到表达载体pET32a(+)中，在Ecoli ER2566中实现了表达； (2)将编码SK3-type dehydfin的基因分别亚克隆到表达载体pETlla和pET28a中，在E．coli BL21(DE3)pLysS中实现了表达，并纯化获得了His-dehydrin融合蛋白； (3)将编码Group3 LEA蛋白的基因亚克隆到表达载体pETlla中实现了表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词及中英文对照

声明

1引言

1.1抗菌肽概述

1.2抗菌肽的作用机理

1.2.1膜破裂机理

1.2.2非膜破裂机理

1.3抗菌肽的应用研究进展

1.3.1在医药中的应用

1.3.2在食品中作为防腐剂

1.3.3在提高植物抗病性中的应用

1.3.4在畜牧生产中作为饲料添加剂

1.4抗菌肽的筛选方法

1.4.1基于分离技术的抗菌肽筛选方法

1.4.2利用差异显示技术筛选抗菌肽编码基因

1.4.3基于同源序列筛选抗菌肽编码基因

1.4.4用生物信息学方法鉴别抗菌肽

1.4.5高通量筛选方法

1.5研究目的及意义

2材料与方法

2.1生物材料

2.2文库的筛选

2.3初筛克隆的固体涂板验证

2.4初筛克隆的液体培养验证

2.5阳性克隆对不同E.COLI菌株的抑菌实验

2.5.1阳性克隆质粒的提取

2.5.2感受态细胞的制备

2.5.3对不同E.coli菌株的抑菌实验

2.6阳性克隆的测序和同源性分析

2.7液体抑菌实验

2.8体外抑菌实验

2.8.1抗菌蛋白提取液的制备

2.8.2考马斯亮蓝法测蛋白浓度

2.8.3指示菌的制备

2.8.4滤纸片的制备

2.8.5抑菌实验

2.9脂转移蛋白的亚克隆、诱导表达

2.9.1引物的设计

2.9.2 Ltp基因的PCR扩增及双酶切

2.9.3载体pET32a(+)的制备

2.9.4 pET32a克隆载体与目的基因片段的连接与转化

2.9.5转化子的PCR鉴定及测序

2.9.6 pET32a-LTP在E.coli ER2566中的诱导表达及Western检测

2.10 SK3-type dehydrin基因的亚克隆

2.10.1引物的设计

2.10.2 Dehydrin基因的PCR扩增及双酶切

2.10.3载体pET11a和pET28a的制备

2.10.4 pET11a和pET28a克隆载体与目的基因片段的连接与转化

2.10.5转化子双酶切鉴定及测序

2.10.6 pET11a-dehydrin和pET28a-dehydrin在E.coli BL21(DE3)pLysS中的诱导表达

2.10.7 Dehydrin蛋白的纯化

2.11 LEA蛋白的亚克隆、诱导表达

2.11.1引物的设计

2.11.2 Lea基因的克隆与诱导表达

3.结果与分析

3.1从水稻根CDNA文库中筛选获得了58个阳性克隆

3.2阳性克隆的测序结果和同源性分析

3.2.1读码框分析

3.2.2与已知抗菌肽序列相同或相似

3.2.3与抗性基因相似

3.2.4与核糖体蛋白同源

3.2.5与丝/苏氨酸磷酸酶相似

3.2.6可能的新的抗菌肽序列

3.3 Ⅰ类克隆有抑菌作用

3.4阳性克隆的抑菌圈

3.5脂转移蛋白的亚克隆、诱导表达

3.5.1 Ltp基因的亚克隆

3.5.2 LTP在ER2566中的表达

3.6 SK3-type dehydrin基因的亚克隆、表达

3.6.1 Dehydrin基因的亚克隆

3.6.2 Dehydrin在E.coli BL21(DE3)pLysS中的表达

3.7编码LEA基因的亚克隆、诱导表达

3.7.1 Lea基因的亚克隆

3.7.2 LEA基因在BL21(DE3)pLysS中的表达

4.讨论

4.1抗菌肽/蛋白的筛选及鉴定

4.2脂转移蛋白的功能

4.3 Dehydrin的功能

4.4 LEA蛋白的功能

5.结论

参考文献

附录

在读期间发表论文

作者简历

致谢