土壤中苏云金杆菌HBF-1菌株毒蛋白ELISA检测方法的建立及应用

摘要

本文以在我国分离获得的对丽金龟科幼虫高毒力的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis简称Bt)HBF-1为供试菌株，以其产生的杀虫晶体蛋白为检测目标，通过制备的抗Bt蛋白多克隆抗体，建立了土壤中HBF-1菌株毒蛋白含量的酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定方法。 抗原是影响抗体特异性和效价的重要因素。为了得到高纯度的杀虫晶体蛋白，本研究采用等电点法沉淀出晶体杀虫蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化粗提的杀虫晶体蛋白，得到分子量约为130kDa的电泳纯杀虫晶体蛋白，作为免疫用抗原。利用该抗原分四次对新西兰白兔进行免疫，获得了高特异性的抗血清，再用辛酸一硫酸铵盐析法，获得了高免血清中的免疫球蛋白IgG，SDS-PAGE电泳结果表明，提取的IgG纯度较高，其浓度达到5.6344mg/mL。采用改良的过碘酸钠法，用辣根过氧化物酶标记IgG，制备出标记率为0.28，克分子比为0.798的酶标抗体。 通过利用直接法、间接法和双抗夹心法等ELISA方法检测土壤中Bt毒蛋白的含量，综合样品检测值的相关系数CV，EC<,50>及检测率三个方面，明确双抗体夹心ELISA法均优于其它两种方法，间接ELISA法次之，从而证明双抗夹心法是一种检测土壤中Bt毒蛋白含量较适宜的方法。明确了双抗体夹心ELISA法的最佳工作条件：抗体的包被量为7μg/mL；Bt杀虫晶体蛋白的3种提取液(Tris-硼酸、Na<,2>CO<,3>缓冲液、PBST)中，以Na<,2>CO<,3>缓冲液为最佳提取液；封闭液为0.1％明胶-PBST；酶标抗体的最适工作浓度为1：800稀释；待测样品的反应时间为37℃ 120min；酶标抗体的时间为37℃ 60min底物显色时间为室温15min。通过对该ELISA法的特异性试验、交叉性试验和重复性试验验证，证明双抗体夹心ELISA法是一种特异、敏感、快速、操作简便的方法。 利用优化的双抗夹心ELISA系统检测花生田里Bt蛋白的消长动态，结果表明利用双抗夹心ELISA法定量测定土壤中Bt蛋白的量能够明确反映出土壤中Bt毒蛋白含量的动态变化情况。在播种期施入Bt毒蛋白，原液及2倍稀释液土深20cm的处理在3d时达到最大含量，随后为平缓下降的趋势；原液和2倍稀释液土深2cm的处理在3d时蛋白含量上升，随后下降，在21d时检测量达到最高峰，随后下降至134d检测结束，在此过程中3～14d深土层20cm的蛋白含量明显高于浅土层2cm，随后除2倍稀释液21d、31d时有所例外，其余各处理均为深土层蛋白量高于浅土层。在开花前期施入Bt毒蛋白，四处理的蛋白含量3d达到最高，随后原液和2倍稀释液土深20cm的处理急剧下降，原液和2倍稀释液土深2cm的处理下降平缓。在开花后期施入Bt毒蛋白，四处理蛋白含量3～7d达到最高，随后呈平缓下降的趋势。因此，在不同施药时期，各处理深土层20cm的Bt蛋白量高于浅土层2cm。总之，在花生开花前期和开花后期进行灌根施药，土壤中Bt蛋白表达高峰期即为铜绿丽金龟(Anomala corpulenta Motshulsky)卵高峰期和幼虫一龄期、二龄初期，能够对金龟子幼虫达到最佳防治效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1 Bt的分类

1.2 Bt的杀虫范围

1.3 Bt杀虫晶体蛋白及其基因

1.4 Bt的生态学分布

1.5土壤中Bt毒蛋白的残留与降解

1.5.1农田土壤中Bt毒蛋白的来源和累积

1.5.2 Bt毒素的微生物利用与降解

1.5.3 Bt毒素与土壤微粒的吸附结合

1.5.4 Bt毒蛋白在土壤中的降解及持续时间

1.6 Bt毒蛋白的测定方法

1.6.1协同凝集反应

1.6.2免疫印迹分析法

1.6.3免疫PCR技术

1.6.4免疫试纸条法

1.6.5流式细胞仪法

1.6.6 ELISA检测法

1.6.7 ELISA在苏云金杆菌晶体蛋白检测中的应用

1.7苏云金芽胞杆菌HBF-1菌株的生物学特性

1.8本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1供试材料

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂

2.1.4实验中所需主要溶液的配制

2.2方法

2.2.1 Bt菌株HBF-1杀虫蛋白的提取与纯化

2.2.2 Bt杀虫蛋白抗体的制备

2.2.3抗血清中免疫球蛋白(IgG)的提取

2.2.4免疫球蛋白(IgG)的含量和纯度测定

2.2.5免疫球蛋白(IgG)的酶标记

2.2.6土壤中Bt杀虫蛋白测定方法的建立

2.2.7 ELISA法测定土壤中HBF-1菌株毒蛋白消长动态

3结果与分析

3.1 Bt毒蛋白抗原的分离纯化

3.2第三次免疫后抗血清效价的测定

3.3末次免疫后抗血清效价的测定

3.4免疫球蛋白(IgG)的提取与浓度的测定

3.5酶标抗体的制备结果

3.6土壤中Bt杀虫蛋白的测定方法的建立

3.6.1三种提取液对土壤中Bt蛋白提取效果的比较

3.6.2三种ELISA方法的研究

3.6.3双抗夹心ELISA法试验条件的选择

3.6.4应用双抗夹心ELISA法检测花生田中Bt菌株HBF-1毒蛋白的消长动态

4讨论

4.1抗原的制备

4.2抗体的制备

4.3抗体的纯化和酶标抗体的制备

4.4三种ELISA方法的比较

4.5双抗夹心ELISA法的建立

4.6土壤中Bt蛋白的消长动态

5结论

参考文献

发表论文

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