枣体细胞胚胎发生及倍性种质创新

摘要

本文以冬枣组培苗叶片为外植体，利用固体培养技术，对影响枣叶片体细胞胚胎发生的多种培养因子进行了研究，并从组织细胞学方面对枣体细胞胚胎形态建成的机理进行了初步研究；进而利用所建立的叶片体细胞胚胎发生培养体系进行了多倍体诱导，并利用花药培养和多细胞起源的不定芽再生体系等多种方法进行了枣的倍性种质创新研究。主要研究结果如下： 1．以冬枣离体叶片为外植体首次建立了冬枣叶片体细胞胚胎发生培养体系。冬枣离体叶片在MS+麦芽糖20g/L+琼脂3g/L+TDZ10.0mg/L的固体培养基上，可获得初始愈伤组织，但愈伤组织在调整渗透压、激素种类、光照条件及添加防褐化剂的情况下仍不能进行继代培养。但将叶片接种在MS+麦芽糖20g/L+琼脂3g/L+TDZ10.0mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L的培养基上暗培养，不经过转换培养基即可一步实现愈伤组织诱导和胚状体分化，分化率达84.9％。获得的胚状体在MS+蔗糖40g/L+琼脂4g/L+CH500mg/L的无激素培养基上发育成熟：在1/2MS+蔗糖20g/L+琼脂4g/L+IBA2.0mg/L的培养基上诱导生根获得完整再生植株。 2．对冬枣离体叶片体细胞胚胎发生过程进行组织细胞学观察发现：(1)枣叶片体细胞胚以间接方式发生，即先由叶片脱分化产生愈伤组织，再从愈伤组织上再分化形成胚状体。(2)枣叶片体细胞胚以单细胞外起源发生，即叶片体细胞胚胎均起源于胚性愈伤组织中的单个胚性母细胞，且大多数胚性母细胞位于愈伤组织近表层的几层细胞。(3)枣体胚发生过程中存在生理隔离现象。(4)枣叶片体细胞胚发生存在不同步化现象。(5)枣叶片体细胞胚发生过程中存在三次淀粉粒积累高峰：胚性愈伤组织时期、球形胚期、鱼雷胚期。 3．开展枣花药培养取得成功。枣花药在MS+麦芽糖20g/L+2,4-D1.0mg/L的培养基上，可诱导出乳白色、块状初始愈伤组织，该类愈伤组织在2,4-D和TDZ作用下均不能进行增殖和分化培养；枣花药在MS+麦芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L的培养基上可诱导出淡黄色、颗粒状初始愈伤组织，该类愈伤组织在MS+麦芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L培养基上继续增殖，保持淡黄色颗粒状，在MS+麦芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L+AgNO<,3>0.5mg/L固体培养基上可诱导胚状体发生。枣花药胚状体易发生玻璃化现象，在MS+蔗糖40g/L+琼脂4.0g/L的培养基上，从三倍体赞皇大枣花药胚状体中获得一株正常植株。经叶片DNA含量和茎尖染色体数目鉴定，本试验首次获得了赞皇大枣的2n花粉植株。经组织细胞学观察，枣花药体细胞胚也以间接方式单细胞外起源方式发生，胚状体发生过程中同样存在生理隔离和不同步化现象，且花药胚状体存在畸形胚。 4．利用叶片体细胞胚胎发生体系一步获得了冬枣纯合四倍体。秋水仙素浸泡法对叶片伤害大，叶片无胚状体发生；利用秋水仙素培养基混培法时，枣叶片有胚状体发生，当培养基秋水仙素浓度为15mg/L时，再生体胚发生变异，经流式细胞仪叶片DNA含量和茎尖染色体数目检测，变异植株为纯合四倍体，染色体数为2n=2x=48。 5．利用叶片直接再生不定芽体系获得了冬枣二、四倍体嵌合体。枣叶片在MS+琼脂3g/L+麦芽糖20g/L+BA1.0mg/L或TDZ1.0mg/L+AgN0O<,3>1.0mg/L的培养基上可直接再生不定芽，不定芽再生率分别为97.3％和90.1％。再生不定芽分别在MS+蔗糖40g/L+琼脂4g/L+BA1.0mg/L+ IBA0.5mg8/L 和 1/2MS+蔗糖 20g/L+琼脂4g/L+IBA1.0mg/L培养基上增殖和生根。利用秋水仙素培养基混培法在叶片不定芽诱导时进行诱变，当培养基中秋水仙素浓度为15mg/L时，再生不定芽发生变异，经流式细胞仪DNA含量检测，变异植株为嵌合体。 6．开展了利用田间枝干愈伤组织不定芽再生体系诱导多倍体研究，在TDZ4.0mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L作用下，枝干截面形成层处可产生大量乳白色愈伤组织，愈伤组织诱导率高达100％，不定芽诱导率为74.2％。但经流式细胞仪DNA含量检测，秋水仙素处理的田间愈伤组织不定芽未发生变异，未能获得多倍体。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1植物体细胞胚胎发生

1.1理论基础

1.2植物体细胞胚胎的研究现状

1.3影响植物体细胞胚胎发生的因素

1.4体细胞胚胎形态建成过程中组织细胞学的研究

2倍性种质创新

2.1单倍体育种-花药培养

2.2多倍体育种

3枣体细胞胚发生及倍性种质创新研究现状

4本研究的目的和内容

第一章枣体细胞胚胎发生培养体系的建立

第一节枣体细胞胚胎发生培养体系的建立

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4 小结

第二节枣叶片体细胞胚胎形态建成过程中组织细胞学的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

第二章枣的倍性种质创新研究

第一节单倍体育种-枣花药培养及组织细胞学观察

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

第二节利用叶片体细胞胚胎发生体系诱导多倍体

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

第三节利用叶片直接再生不定芽体系诱导多倍体

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

第四节田间愈伤组织不定芽诱导多倍体

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

4小结

总讨论

结论

参考文献

图版一

图版二

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢