重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达及犬IFN-γ腺病毒载体的构建

摘要

干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)主要由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生，丝裂原以及抗原特异性刺激T淋巴细胞克隆也可产生。它除了具有抗病毒、抗肿瘤活性外，还起着重要的免疫调节作用，如活化巨噬细胞、提高MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达、促进抗原提呈，诱导Th1细胞的分化等，在机体对肿瘤及多种胞内病原感染的免疫控制和免疫病理中起着重要的作用。由于IFN-γ对机体免疫系统具有极大的调节作用，是机体发挥免疫功能，清除体内病原体不可缺少的成分。因此IFN-γ既可以作为药剂用于感染性疾病或肿瘤等的治疗，又可以作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果。 为了建立一套犬IFN-γ(canine interferon-γ，CaIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法，本研究用伴刀豆球蛋白A(conA)刺激犬脾细胞，通过RT-PCR方法从犬脾细胞中扩增得到犬IFN-γ基因。分离纯化扩增片段，并将其克隆到pcDNA3.1A载体中，再转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经过酶切鉴定筛选出阳性克隆，测序鉴定。构建的真核表达载体pcDNA3.1A-CalFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明，克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致，同源性100％。表达产物经Western-blot方法检测，证明克隆的犬IFN吖基因能够在HEK293T细胞中进行表达，并且表达产物能够分泌到细胞外。犬IFN-γ重组表达质粒的成功构建与真核表达，为以后进行犬IFN-γ活性分析和生物学功能的研究奠定了基础。 本研究在犬IFN-γ基因进行真核细胞表达的基础上，构建了犬IFN-γ基因的重组腺病毒载体。采用体外连接的重组腺病毒方法，在表达质粒pcDNA3.1A-CalFN-γ-STOP上通过Kpn I和Adpa I双酶切获得包含终止密码子的CalFN-γ片段，重组到穿梭质粒pShuttle3/gfp)的人巨细胞病毒启动子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(polyA)之间的多克隆位点内，得到重组穿梭质粒pShuttle3/gfp-CalFN- γ，进行酶切鉴定。以PI-Sce I和1-Ceu I双酶切重组穿梭质粒，获得含有CMV-CaWN-γ的表达盒，与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接，经Swa I酶切去除Adeno-X Viral DNA自身环化质粒，再转化感受态DH5a，重组成pAdeno-CalFN-γ腺病毒质粒，鉴定成功后再经Pac I酶切线性化并暴露其两端的反向重复序列(ITTRs)，脂质体法转染HEK293细胞，待出现细胞病变效应后收集细胞，-20℃2～37℃反复冻融细胞3次得到含重组病毒的病毒液，包装成为重组CalFN-γ腺病毒。取部分病毒液加入HEK293细胞中扩增病毒，并进行PCR鉴定。结果表明携带犬IFN-γ的腺病毒载体的构建成功，并能在HEK293细胞包装，这为以后进行犬病毒病的基因治疗等研究奠定了一定基础

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词索引表

声明

1引言

1.1干扰素研究概述

1.1.1干扰素的分类

1.1.2干扰素的产生机理

1.1.3干扰素的基本特性

1.1.4干扰素的生物学特性

1.1.5干扰素的生物学活性及作用机理

1.2腺病毒载体概述

1.2.1腺病毒基本结构及感染机理

1.2.2腺病毒载体的构建基础及构建方法

1.2.3腺病毒载体的发展过程

1.2.4腺病毒载体的优点

1.2.5腺病毒载体的应用

1.2.6腺病毒载体的缺点

1.2.7腺病毒载体的改良对策

1.3犬干扰素的基因工程

1.4本研究的目的及意义

1.5研究目标

2实验一重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达

2.1材料

2.1.1试验动物

2.1.2载体、菌株及细胞株

2.1.3主要试剂

2.1.4试验所用溶液及其配制

2.1.5主要仪器设备

2.2方法

2.2.1犬脾淋巴细胞总RNA的提取

2.2.2犬IFN-γ基因的扩增

2.2.3克隆、表达载体pcDNA3.1A-CaIFN-γ和pcDNA3.1A-CaIFN-γ-STOP的构建

2.2.4犬IFN-γ蛋白的表达与鉴定

2.3结果与分析

2.3.1犬IFN-γ基因的扩增结果

2.3.2真核表达载体pcDNA3.1A-CaIFN-γ和pcDNA3.1A-CaIFN-γ-STOP的构建

2.3.3犬IFN-γ基因测序结果

2.3.4犬IFN-γ在HEK293T细胞中表达

2.4讨论

3实验二重组犬IFN-γ腺病毒载体的构建

3.1材料

3.1.1载体、菌株及细胞株

3.1.2主要试剂

3.1.3试验所用溶液及其配制

3.1.4主要仪器设备

3.2方法

3.2.1构建穿梭质粒pShuttle3/gfp-CaIFN-γ

3.2.2重组腺病毒质粒pAd-CaIFN-γ的构建

3.2.3再生犬IFN-γ的重组腺病毒

3.2.4重组犬IFN-γ腺病毒的鉴定

3.3结果与分析

3.3.1穿梭质粒pShu3/gfp-CaIFN-γ的构建

3.3.2重组腺病毒质粒pAd-CaIFN-γ的构建

3.3.3犬IFN-γ重组腺病毒的再生与鉴定

3.4讨论

4结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢