利用AFLP和SSR鉴定苹果砧木及SH40自然实生后代父本

摘要

选择利用具有较高耐盐能力的砧木是提高苹果耐盐力的关键，培育耐盐力强的砧木是其基础。培育及鉴定耐盐砧木时，涉及到亲本选择、亲本鉴定等系列问题。本试验利用AFLP和SSR分子标记对我国苹果生产中的30个重要砧木进行了研究，以期为中国优良砧木资源的进一步收集和利用提供科学依据；同时，对耐盐SH40自然实生后代进行亲本鉴定，既为杂交中亲本的选配提供理论参考，也为后期耐盐筛选、性状鉴定奠定基础。主要研究结果如下: 1.确定了适于AFLP分析的苹果基因组DNA的提取方法(改良CTAB法),其提取液成分为:基本提取液(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2％CTAB)中添加1％PVP40、10mmol/L Na2S2O5和2％β-巯基乙醇等防酚抗氧化物质。粗提后的DNA经RNase酶除去RNA，氯仿/异戊醇抽提两次，无水乙醇沉淀，得到了RNA去除彻底、纯度高、质量好的苹果基因组DNA。 2.优化了适于苹果分析的AFLP银染技术体系:在20μL，酶切体系中，包括基因组DNA 450 ng,Msel和EcoRI的用量各为3U，酶切时间以37℃下酶切4小时为最佳；加入接头后，37℃连接10h以上(或过夜)；连接产物稀释10倍后进行预扩增；预扩增产物稀释10倍后再进行选择性扩增；加10μL Loading buffer，95℃变性10min，立即冰浴；在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析;银染法检测PCR产物。 3.确立了苹果砧木SSR反应体系:15μL，体系中，包括基因组DNA 100 ng，10×PCR Buffer(with Mg2+)1.5μL，dNTP 0.25mmol·L-1，引物0.33μmol·L-1，Taq聚合酶1.0U。 4.从64对AFLP引物组合中筛选出7对多态性高、条带清晰、分布均匀的引物组合进行扩增分析，7对引物在SH40实生后代及其亲本中共扩增出条带382条，其中多态性条带328条，占总带数的86.1％，采用NTSYSpc2.1进行统计分析，根据相似系数和特征带共鉴定出81株SH40自然实生后代的父本，鉴定率达72.3％。选用其中的3对引物组合构建了30个苹果砧木的AFLP指纹图谱，每对引物都能将所有砧木鉴别开。3对引物共扩增出199条带，其中多态性条带176条，多态性百分率为88.4％，12个类型具有特征带，占砧木总数的40％。 5.从12对SSR引物中筛选2对多态性高、质量高的引物用于扩增分析:构建了30个苹果砧木的SSR指纹，采用二歧分类法可以将供试材料一一区分开，并且部分材料拥有自己的特征带，可以作为该材料鉴定的依据；构建了118份SH40自然实生后代及其亲本的SSR指纹，通过特征带鉴定出11株SH40自然实生后代的父本，鉴定率为9％。 6.比较AFLP和SSR两种分子标记用于苹果砧木和SH40自然实生后代父本鉴定的高效性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词目录

声明

1引言

1.1果树种质鉴定技术

1.1.1常规鉴定

1.1.2 DNA指纹分析技术

1.1.3几种分子标记比较分析

1.2分子标记技术在果树上的应用进展

1.2.1果树种质资源鉴定

1.2.2物种及品种亲缘关系分析

1.2.3遗传图谱的构建

1.2.4基因标记、定位和克隆

1.2.5分子标记辅助选择育种

1.3结语

1.4研究目的及意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2主要仪器和试剂

2.2.1主要仪器

2.2.2试剂

2.3苹果基因组DNA的提取

2.4模板DNA纯度和浓度检测

2.4.1琼脂糖凝胶电泳检测DNA

2.4.2紫外分光光度法检测

2.5 AFLP分析

2.5.1苹果AFLP银染技术体系

2.5.2引物筛选

2.6 SSR分析

2.6.1 SSR引物

2.6.2 SSR分析体系优化

2.6.3引物筛选

2.7结果统计与数据分析

2.7.1结果统计

2.7.2多态性百分率

2.7.3相似系数

2.7.4聚类分析

3结果与分析

3.1 DNA模板提取方法的改进

3.2 AFLP分析

3.2.1酶切效果

3.2.2预扩增体系

3.2.3选择性扩增体系

3.2.4引物的筛选

3.2.5 30个苹果砧木的AFLP结果分析

3.2.6 SH40实生后代的AFLP分析

3.3 SSR 分析

3.3.1 SSR分析体系的优化

3.3.2引物退火温度对扩增结果的影响

3.3.3 30个苹果砧木的SSR鉴定

3.3.4 SH40实生后代的SSR鉴定

4 讨论

4.1苹果叶片DNA提取方法

4.2 AFLP较SSR用于苹果砧木鉴定的高效性

4.3苹果砧木亲缘关系分析

4.4分子标记鉴定SH40实生后代的可行性

4.5 AFLP、SSR用于亲本鉴定的有效性

4.6 SH40自然实生后代父本的AFLP鉴定结果分析

5结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢