棉花黄萎菌拮抗枯草芽孢杆菌NCD-2抑菌物质的分离及性质分析

摘要

枯草芽孢杆菌NCD-2是从根际土壤中分离筛选到的一株对棉花黄萎病病原菌具有较强抑制作用的菌株，并对棉花黄萎病表现出较理想的防治效果。 通过对NCD-2菌株培养条件(培养基、培养温度、培养时间和pH值)的研究，得到了抗菌物质产生的最佳条件为:在NB液体培养基中、30℃、pH=7、摇床培养(180rpm)2d，所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。 通过对最佳条件下获得的NCD-2菌株培养液进行硫酸铵沉淀(30％～80％)，并用14000D透析袋透析获得对棉花黄萎菌有抑制作用的蛋白粗提液。通过RNA酶，蛋白酶K和胰蛋白酶分别对该蛋白粗提液处理发现，经RNA酶处理后蛋白液的抑菌活性与对照相比差异不显著，经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后蛋白粗提液的抑菌活性与对照相比显著降低；蛋白粗提液经热(60℃、80℃、100℃、120℃)处理30 min，结果表明经60℃处理后的抑菌活性与对照相比差异不显著，经80℃、100℃、120℃处理后抑菌活性与对照相比显著下降，但经120℃处理30 min后仍有一部分抑菌活性。因此初步说明抑菌菌物质含有不耐热蛋白类物质。 本文对30％～80％饱和硫酸铵沉淀的蛋白粗提液进行了进一步的研究，以确定抑菌物质的成分，即30％～80％硫酸铵沉淀的蛋白粗提液经DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析得到3个组分，其中第二组分有抑菌活性，该组分通过Sephacry S-100凝胶过滤分离得到3个组分S-1、S-2和S-3，其中S-1和S-3两个组分经活性检测为抑菌组分，经RPC分析已达到分离纯。 本文对小分子的脂肽类抑菌物质也进行了简单的分析，以确定小分子脂肽类抑菌物质的成分，即浓盐酸沉淀的脂肽类抗生素粗提液与标准品Surfactin、IturinA进行HPLC比较分析，结果表明NCD-2菌株的抑菌活性物质由多种成分构成，其中含有与IturinA相似的成分，进一步采用了ESI-MS对NCD-2菌株胞外抑菌物质粗提液与标准品Surfactin、IturinA进一步比较分析，发现NCD-2菌株的抑菌活性物质中含有分子量与标准品IturinA相同的3种同系物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1引言

1.1棉花黄萎病及其防治策略

1.2生防芽孢杆菌的特点及防病机理

1.2.1芽孢杆菌及其应用

1.2.2芽孢杆菌的防病机理

1.3芽孢杆菌产生的活性物质

1.4色谱技术在物质分离纯化中的应用

1.5质谱(MS)分析在物质鉴定中的应用

1.6本研究的目的意义

2试验材料

2.1供试菌种

2.2试剂

2.2.1所用培养基

2.2.2药品和缓冲液

2.3主要仪器

3试验方法

3.1 NCD-2菌株无菌体培养液制备

3.2抑菌活性测定

3.3培养条件对NCD-2菌株发酵液抑菌活性的影响

3.4NCD-2菌株无菌体培养液中蛋白粗提液制备

3.4.1不同饱和度的硫酸铵盐析对抑菌效果的影响

3.4.2 NCD-2菌株无菌体培养液中蛋白粗提液制备

3.4.3蛋白粗提液对棉花黄萎病病原菌的抑菌活性测定

3.5蛋白粗提液含量及性质初步测定

3.5.1蛋白质含量的测定

3.5.2抑菌粗蛋白对RNA酶和蛋白酶的稳定性

3.5.3热处理对抑菌粗蛋白活性的影响

3.5.4数据统计分析

3.6活性物质的纯化及鉴定

3.6.1蛋白类活性物质的制备

3.6.2蛋白类抑菌物质的层析分离

3.6.3脂肽类抑菌物质的制备

3.6.4脂肽类抑菌物质的反相液相色谱(RPC)检测

3.6.5质谱(mass spectrometry，MS)分析

4结果与分析

4.1 NCD-2菌株无菌体培养液对棉花黄萎病病原菌的抑制作用

4.2培养条件对NCD-2菌株培养液抑菌活性的影响

4.2.1不同培养基的影响

4.2.2不同温度的影响

4.2.3不同pH的影响

4.2.4不同的培养时间的影响

4.3 NCD-2菌株无菌体培养液中蛋白粗提液制备及抑菌活性测定

4.3.1不同饱和度硫酸铵对抑菌效果的影响

4.3.2蛋白粗提液抑菌活性测定

4.4蛋白粗提液含量及性质初步测定

4.4.1蛋白含量的测定

4.4.2抑菌粗蛋白对蛋白酶和RNA酶的稳定性

4.4.3抑菌粗蛋白提取液对热的稳定性

4.5蛋白类抑菌物质的层析分离

4.5.1蛋白类抑菌物质的离子色谱柱预分离

4.5.2蛋白类抑菌物质的DEAE弱阴离子色谱柱分离

4.5.3 Sephacry S-100凝胶过滤纯化

4.5.4 RPC分析测定

4.5.5 SDS-PAGE凝胶电泳

4.6NCD-2菌株无菌体培养液中脂肽类抑菌物质的抑菌活性测定

4.7脂肽类抑菌物质的反相液相色谱(RPC)检测

4.8脂肽类抑菌物质与标准品Surfactin、Iturin的ESI-MS检测分析

5讨论

5.1关于芽孢杆菌NCD-2菌株的发酵

5.2关于蛋白类抑菌物质的分离纯化

5.3关于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量

5.4关于脂肽类抑菌物质分析

5.5枯草芽孢杆菌对植物病害生物防治存在的问题和展望

6 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢